黃璐瑤 張文壯 錢亞 吳家勁 張國建 車茜 李德海 朱天驕

(海洋藥物教育部重點實驗室，中國海洋大學醫(yī)藥學院，青島 266000)

極地地區(qū)包含南極，北極及其亞區(qū)。其環(huán)境特殊，具有鹽分高，輻射強，光照時間短，永久寒冷，營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的特點，為了適應這種極端的氣候條件，極地微生物形成了獨特的代謝機制，具有形成新穎代謝產(chǎn)物的潛力，是天然產(chǎn)物研究的重要資源。但由于自然條件惡劣，樣品采集困難，極地微生物資源的藥用價值研究較少[1-3]。我國在極地微生物藥用資源研究方面起步較晚，但發(fā)展較為迅速，已成為國際上極地微生物代謝產(chǎn)物研究的重要力量[4-6]，然而目前對北極微生物代謝產(chǎn)物的研究仍然較少，自2013年以來才有少量報道[7]。目前報道的結(jié)構(gòu)類型主要包含萜類[8]、環(huán)肽類[9]、聚酮類[10]和生物堿類[11]，這些結(jié)構(gòu)大多具有良好的生物活性，如菌株Eutypellasp.D-1中分離到的化合物eutypenoids B[11]，具有顯著免疫抑制活性。菌株Tolypocladium cylindrosporumSCSIO 40433中分離到的化合物cylindromicin[12]，具有顯著的酪氨酸酶抑制活性。這些活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)對新藥研發(fā)具有一定的意義。本文對1株北極沉積物來源真菌Aspergillussp.HDN19-401的代謝產(chǎn)物進行研究，共分離得到9個化合物，通過核磁數(shù)據(jù)分析和對比確定了它們的化學結(jié)構(gòu)，如圖1所示，分別為6-O-methylaverufin(1)[13],6,8-di-O-methylaverufin(2)[14],6,8-di-O-methylnidurufin(3)[14],aversin(4)[15],oxisterigmatocystin A(5)[16],oxisterig-matocystin B(6)[16]，fellutamide C(7)[17],notoamides B(8)[18]和notoamides C(9)[18]。對化合物進行抗真菌，抗細菌以及抗腫瘤活性測試的結(jié)果表明，化合物5對蠟狀芽胞桿菌，大腸埃希菌有弱的抑制活性，MIC值為25 μmol/L；化合物7對人慢性髓系白血病細胞K562具有中等的抑制活性，IC50值為7.78 μmol/L。

圖1 化合物1～9的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of compounds 1～9

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液質(zhì)聯(lián)用分析儀Acquity UPLC H-Class coupled to a SQ Detector 2 mass spectrometer (Waters)；Chromaster分析型高效液相色譜儀(日立科學儀器有限公司)；Chromaster半制備型高效液相色譜儀(日立科學儀器有限公司)；Sephadex? LH-20(Pharmacia公司)；JNM-ECP600型核磁共振儀(日本JEOL公司)；Bruker AV-400MHz超導核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；柱色譜硅膠(青島海洋化工有限公司)；POLAX-L型旋光儀(美國ATAGO公司)；ZF-20C暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠)；EZ-DRY型冷凍干燥機(美國FTS公司)；EYELAN-N 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化公司)；分析純、色譜純試劑(天津市富宇精細化工有限公司)；核磁所用氘代試劑(上海邁瑞爾)。

1.2 菌株

菌株信息：真菌Aspergillussp.HDN19-401(Genbank No.OM390581)，分離自北極LV83-14站位(133°37'1.32''E；77°23'9.12''N)的沉積物樣品，菌株存放于中國海洋大學醫(yī)藥學院海洋藥用生物資源中心。

菌株發(fā)酵：菌株用PDB培養(yǎng)基(馬鈴薯浸出粉6.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L，海水配制)發(fā)酵36 L，室溫靜置培養(yǎng)30 d。

1.3 提取與分離

發(fā)酵后將菌絲體與發(fā)酵液分別處理，發(fā)酵液加入等體積乙酸乙酯，在攪拌罐中80 r/min攪拌30 min，重復萃取3次后濃縮獲得浸膏；菌絲體破碎后加等體積甲醇，超聲30 min，萃取3次后濃縮獲得浸膏。2個浸膏經(jīng)HPLC分析，表明成分一致，合并后獲得總浸膏11.0 g。經(jīng)反相硅膠柱色譜梯度(甲醇/水：4:6～10:0)洗脫，分析合并獲得12個組分(Fr.1～Fr.12)。Fr.8經(jīng)半制備高效液相色譜(乙腈/水，70:30)分離獲得化合物1(2 mg)；Fr.10經(jīng)半制備高效液相色譜(甲醇/水，88:12)分離獲得化合物2(3 mg)；Fr.7經(jīng)兩次半制備高效液相色譜(甲醇/水，80:20)(甲醇/水，60:40)分離獲得化合物3(4 mg)和4(3 mg)以及組分Fr.7-2，F(xiàn)r.7-2經(jīng)Sephadex? LH-20凝膠色譜柱(流動相為甲醇)以及半制備高效液相色譜(甲醇/水，60:40)純化獲得化合物7(4.5 mg)；Fr.6經(jīng)半制備高效液相色譜(乙腈/水，45:55)分離獲得兩個組分Fr.6-1，F(xiàn)r.6-2，F(xiàn)r.6-1經(jīng)Sephadex? LH-20凝膠色譜柱(流動相為甲醇)以及半制備高效液相色譜(甲醇/水，67:33)純化獲得化合物8(3.1 mg)和9(2.3 mg)，F(xiàn)r.6-2經(jīng)半制備高效液相色譜(甲醇/水，60:40)分離得到化合物5(10.2 mg)以及組分Fr.6-2-2，F(xiàn)r.6-2-2經(jīng)半制備高效液相色譜(乙腈/水，50:50)分離得到化合物6(2.6 mg)。

1.4 活性測試

(1)抑菌活性：采用微量肉湯稀釋法，測定化合物對1種真菌，白念珠菌(Candida albicans)以及8種細菌，即副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)、草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda，Et)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)的抗菌活性，其中副溶血弧菌為海洋致病菌，真菌陽性對照為制霉菌素，細菌陽性對照為環(huán)丙沙星，二甲基亞砜(DMSO)為陰性對照，具體操作見參考文獻[19]。

(2)細胞毒活性：采用MTT法，測定所有化合物對人慢性髓原白血病細胞K562和人非小細胞肺癌細胞NCI-H358兩種細胞系的細胞毒活性，陽性對照為阿霉素，具體操作見參考文獻[20]。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：橘紅色粉末；陽離子ESI-MS：m/z383.1 [M+H]+，化合物分子式為C21H18O7；1H NMR(600 MHz,d6-DMSO) δH: 14.06 (1H,s,1-OH),7.14(1H,s,H-5),6.95 (1H,s,H-4),6.76 (1H,s,H-7),5.26(1H,d,J=3.0,H-1'),3.88 (3H,s,H-11),2.00 (1H,m,H-4'a),1.98 (1H,m,H-2'a),1.81 (1H,m,H-4'b),1.74(3H,m,H-2'b),1.63 (1H,m,H-3'a),1.51 (3H,m,H-6'),1.42 (1H,m,H-3'b);13C NMR (151 MHz,d6-DMSO)δC: 185.3(C-9),182.2 (C-10),163.5(C-8),158.6(C-1),158.4(C-3),136.6(C-5a),132.3(C-4a),116.2(C-2),109.7(C-1a),108.1(C-5),105.2(C-4),105.0(C-7),100.7(C-5'),66.2(C-1'),56.2(C-11),35.3(C-4'),27.5(C-6'),27.0(C-2'),15.4(C-3')。通過對比文獻數(shù)據(jù)[13]，鑒定結(jié)構(gòu)為6-O-methylaverufin。

化合物2：黃色固體；陽離子ESI-MS：m/z397.4 [M+H]+；化合物分子式為C22H20O7；1H NMR(600 MHz,CDCl3) δH: 13.54 (1H,s,1-OH),7.43 (1H,d,J=2.4,H-5),7.19 (1H,s,H-4),6.76 (1H,d,J=2.4,H-7),5.37 (1H,m,H-1'),4.00 (3H,s,H-11),3.96 (3H,s,H-12),2.05 (1H,m,H-2'a),2.03 (1H,m,H-4'a),1.88 (1H,m,H-2'b),1.81 (1H,m,H-4'b),1.66 (2H,m,H-3'),1.56(3H,s,H-6');13C NMR(151 MHz,CDCl3)δC:186.9(C-9),182.7 (C-10),165.0(C-6),162.9(C-8),159.7(C-3),159.7(C-1),137.7 (C-5a),132.6(C-4a),116.9 (C-2),115.4(C-8a),110.1(C-1a),107.1(C-4),104.9(C-7),104.0(C-5),101.0(C-5'),67.2(C-1'),56.7(C-11),56.1 (C-12),36.0(C-4'),27.9(C-6'),27.5(C-2'),16.1(C-3')。通過對比文獻數(shù)據(jù)[14]，鑒定結(jié)構(gòu)為6,8-di-O-methylaverufin。

化合物3：黃色固體；陽離子ESI-MS：m/z413.1 [M+H]+；化合物分子式為C22H20O8；1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH: 13.59 (1H,s,1-OH),7.45(1H,d,J=2.4,H-5),7.22 (1H,s,H-4),6.79 (1H,d,J=2.4,H-7),5.25 (1H,s,H-2'),4.30 (1H,t,H-1'),4.02 (3H,s,H-11),3.98 (3H,s,H-12),2.19 (1H,m,H-4'a),1.93(1H,m,H-4'b),1.74 (1H,m,H-3),1.63(3H,s,H-6');13C NMR (151 MHz,d6-DMSO) δC: 186.4 (C-9),182.1 (C-10),159.3 (C-3),165.5 (C-6),163.6 (C-8),159.4 (C-1),137.1 (C-5a),132.1(C-4a),115.9 (C-2),114.4(C-8a),65.6 (C-1'),110.1(C-1a),105.4 (C-7),105.1 (C-5),106.3(C-4),27.8 (C-4'),56.7 (C-11),57.2 (C-12),71.4 (C-2'),23.3 (C-3'),101.7 (C-5'),30.8 (C-6')。通過對比文獻數(shù)據(jù)[14]，鑒定結(jié)構(gòu)為6,8-di-O-Methylnidurufin。

化合物4：黃色固體；陽離子ESI-MS：m/z369.1 [M+H]+；化合物分子式為C20H16O7；1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH: 13.50 (1H,s,1-OH),7.21 (1H,s,H-4),7.44 (1H,d,J=2.4,H-5),6.77 (1H,d,J=2.4,H-7),6.44 (1H,d,J=5.7,H-1'),4.15 (1H,dd,H-2'),4.15 (1H,dd,J=8.3,J=6.0,H-4'a),4.02 (3H,s,H-11),3.98 (3H,s,H-12),3.66 (1H,dd,H-4'b),2.35 (1H,dd,H-3'a),2.26(1H,dd,H-3'b);13C NMR (101 MHz,d6-DMSO) δC:186.4(C-9),181.9(C-10),165.2(C-3),164.7(C-6),163.4(C-8),159.8(C-1),136.8(C-5a),134.6(C-4a),120.7(C-2),113.9(C-8a),113.5(C-1'),112.4 (C-1a),105.1(C-7),104.8(C-5),100.1(C-4),67.6(C-4'),57.0(C-11),56.6(C-12),44.1(C-2'),30.7(C-3')。通過對比文獻數(shù)據(jù)[15]，鑒定結(jié)構(gòu)為aversin。

化合物5：黃色固體；陽離子ESI-MS：m/z387.5 [M+H]+；化合物分子式為C20H18O8；1H NMR(400 MHz,d6-DMSO)δH: 12.71 (1H,s,8-OH),7.38 (1H,d,J=8.9,H-6),6.65 (1H,d,J=8.9,H-7),6.62 (1H,s,H-2),6.59 (1H,d,J=6.1,H-1'),5.25 (1H,d,J=4.7,H-4'),4.21 (1H,dd,J=6.5,8.9,H-2'),3.88 (3H,s,1-OCH3),3.87 (3H,s,5-OCH3),3.09 (3H,s,4'-OCH3),2.76 (1H,s,H-3'a),2.28 (1H,s,H-3'b);13C NMR (151 MHz,d6-DMSO)δC: 180.9(C-9),165.5(C-3),163.4(C-1),154.7(C-8),153.6 (C-10),144.5(C-13),139.6(C-5),121.3(C-6),114.3(C-1'),109.6(C-11),109.2(C-7),108.4 (C-4),106.9(C-4'),105.2(C-12),91.3(C-2),58.0(5-OCH3),57.2(1-OCH3),55.1(4'-OCH3),42.5(C-2'),36.8(C-3')。通過對比文獻數(shù)據(jù)[16]，鑒定結(jié)構(gòu)為oxisterigmatocystin A。

化合物6：黃色固體；陽離子ESI-MS：m/z387.5 [M+H]+；化合物分子式為C20H18O8；1H NMR(400 MHz,d6-DMSO)δH: 12.67 (1H,s,8-OH),7.39(1H,d,J=9.0,H-6),6.68 (1H,d,J=8.8,H-7),6.66(1H,s,H-2),6.52 (1H,d,J=5.9,H-1'),5.18 (1H,t,J=5.0,H-4'),4.27 (1H,m,H-2'),3.89 (3H,s,1-OCH3),3.88 (3H,s,5-OCH3),2.54(3H,S,4'-OCH3),2.43(1H,m,H-3'a),2.21 (1H,m,H-3'b);13C NMR(151 MHz,d6-DMSO)δC: 180.9(C-9),165.3(C-3),163.6 (C-1),154.6(C-8),154.3(C-10),144.5(C-13),139.7(C-5),121.4(C-6),112.2(C-1'),109.6(C-11),109.4(C-7),107.3(C-4),107.1(C-4'),105.7(C-12),91.5(C-2),58.1(5-OCH3),57.3(1-OCH3),56.6(4'-OCH3),42.5 (C-2'),36.3 (C-3')。通過對比文獻數(shù)據(jù)[16]，鑒定結(jié)構(gòu)為Oxisterigmatocystin B。

化合物7: 淺紫色固體；陽離子ESI-MS：m/z558.7[M+H]+；化合物分子式為C27H51N5O7；1H NMR(400 MHz,d6-DMSO)δH: Lol: 3.28 (1H,m,H-1a),3.18(1H,m,H-1b),3.77 (1H,m,H-2),1.27-1.38 (2H,m,H-3),1.57(1H,m,H-4),0.81(1H,d,H-5),0.86 (1H,m,H-6); Gln: 7.44(1H,d,7-NH),1.71(1H,m,H-15a),1.71(1H,m,H-15b),4.09(1H,m,H-9),1.91 (1H,m,H-10a),1.71 (1H,m,H-10b),2.06(2H,m,H-11),7.20(1H,s,13-NH2a),6.74(1H,s,13-NH2b); Asn:7.99(1H,d,J=7.0,H-14),4.47(1H,q,J=6.7,H-16),2.55(1H,d,J=6.6,H-17a),2.44(1H,d,J=6.8,H-17b),7,41(1H,s,H-18),6.94(1H,s,H-19a),8.10(1H,d,J=7.4,H-19b); 3-HAD: 2.20(2H,m,H-22),3.77(1H,m,H-23),1.24-1.38(2H,m,H-24-31),0.86(2H,d,H-32),4.55(1H,t,J=5.7,1-OH),4.64(1H,d,J=5.0,23-OH);13C NMR (151 MHz,d6-DMSO)δC: 64.3(C-1),49.3 (C-2),40.6 (C-3),24.0 (C-4),22.4 (C-5),22.6 (C-6),171.1(C-8),53.2 (C-9),28.3 (C-10),32.0 (C-11),174.5 (C-12),171.5 (C-15),50.4 (C-16),37.5 (C-17),172.3(C-18),171.8 (C-21),44.0 (C-22),68.0 (C-23),37.4 (C-24),25.7 (C-25),29.7 (C-26),29.6 (C-27),29.5 (C-28),29.3(C-29),31.9 (C-30),21.8 (C-31),14.5 (C-32)。通過對比文獻數(shù)據(jù)[17]，鑒定結(jié)構(gòu)為fellutamide C。

化合物8: 黃色固體；陽離子ESI-MS：m/z448.4[M+H]+；化合物分子式為C26H29N3O4；1H NMR(600 MHz,d6-Acetone)δH: 9.52 (1H,s,H-1),7.09(1H,d,J=5.4,H-4),6.41 (1H,d,J=5.4,H-5),2.22(1H,d,J=9.7,H-10a),3.03 (1H,d,J=9.4,H-10b),3.45 (1H,m,H-14a),3.51(1H,m,H-14b),1.83(1H,m,H-16a),2.67(1H,m,H-16b),8.03(1H,s,H-19),1.83 (1H,m,H-20a),2.02(1H,m,H-20b),3.37(1H,m,H-21),0.80(3H,m,H-23),0.83(3H,m,H-24),6.65(1H,d,J=6.6,H-25),5.75(1H,d,J=6.5,H-26),1.40(3H,s,H-28),1.41(3H,s,H-29);13C NMR(151MHz,d6-Acetone)δC: 184.1 (C-2),62.6(C-3),127.5(C-4),109.7(C-5),153.8(C-6),105.8(C-7),139.3 (C-8),123.6 (C-9),34.9 (C-10),67.1 (C-11),170.5 (C-12),44.4 (C-14),25.5 (C-15),30.4 (C-16),69.4(C-17),174.2(C-18),31.1(C-20),56.9(C-21),46.4(C-22),23.9(C-23),20.4(C-24),117.7(C-25),131.3(C-26),76.7(C-27),28.1(C-28),28.1(C-29)。通過對比文獻數(shù)據(jù)[18]，鑒定結(jié)構(gòu)為notoamides B。

化合物9: 黃色固體；陽離子ESI-MS：m/z450.5[M+H]+；化合物分子式為C26H31N3O4；1H NMR (600 MHz,d6-Ace-tone)δH: 9.88 (1H,s,H-1),7.03(1H,d,J=5.4,H-4),6.36 (1H,d,J=5.4,H-5),2.51(1H,m,H-10a),2.48 (1H,m,H-10b),3.93(1H,m,H-11),3.22 (1H,m,H-14a),3.38(1H,m,H-14b),1.71(1H,m,H-15a),1.71(1H,m,H-15b),1.30(1H,m,H-16a),2.01 (1H,m,H-16b),3.89 (1H,m,H-17),5.01(1H,d,J=11.6,H-20a),5.06(1H,d,J=7.4,H-20b),6.14(1H,dd,J=7.4,11.6,H-21),1.02(3H,s,H-23),1.09(3H,s,H-24),6.63(1H,d,J=6.6,H-25),5.75(1H,d,J=6.6,H-26),1.40(3H,s,H-28),1.42(3H,s,H-29);13C NMR(151 MHz,d6-DMSO)δC: 180.9 (C-2),56.0 (C-3),127.7(C-4),107.9(C-5),152.6(C-6),104.7(C-7),139.7 (C-8),120.9(C-9),30.5 (C-10),53.5(C-11),165.0 (C-12),45.2 (C-14),22.1 (C-15),29.3 (C-16),58.5 (C-17),168.8(C-18),113.8 (C-20),143.9 (C-21),42.7(C-22),21.6(C-23),22.6(C-24),117.5(C-25),129.2(C-26),76.2(C-27),28.0(C-28),28.2(C-29)。通過對比文獻數(shù)據(jù)[18]，鑒定結(jié)構(gòu)為notoamides C。

2.2 化合物生物活性測試

采用微量肉湯稀釋法對所有化合物進行抑菌活性測試，結(jié)果表明化合物5對蠟狀芽胞桿菌，大腸埃希菌有弱的抑制活性，MIC值為25 μmol/L，其余MIC值均大于或等于50 μmol/L。細胞毒活性結(jié)果顯示化合物7對K562細胞具有中等抑制活性，IC50值為7.78 μmol/L。

3 討論

本文對北極來源真菌Aspergillus sp.HDN19-401的次級代謝產(chǎn)物進行了研究，共分離得到9個化合物，除化合物2曾從一株南極來源曲霉屬真菌中分離得到外[21]，其余均為首次從極地來源真菌中獲得。根據(jù)文獻報道，化合物7對人肺腺癌細胞A549，人卵巢腺瘤細胞SK-OV3，人惡性黑色素瘤細胞SKMEL-2，人中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細胞XF498，人結(jié)腸癌細胞HCT15中的大多數(shù)都具有細胞毒性，且對后三者更為敏感(ED50＜5.1 μg/mL)[17]，而7對K562細胞的活性為首次報道?；衔?和9對人宮頸癌細胞HeLa 229和小鼠白血病細胞L1210細胞系具有中等的細胞毒性，IC50值為22～52 μg/mL[18]?；衔?和6為sterigmatocystins類化合物，此類化合物對動物具有致癌性，可誘導大鼠肝細胞癌，鱗狀細胞癌，已被公認為2B類致癌物[22]。相比于其他具有類似結(jié)構(gòu)的海洋來源的曲霉屬真菌[23-24]，菌株Aspergillussp.HDN19-401具有更高的化合物多樣性。研究結(jié)果初步表明，極地來源真菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣的代謝產(chǎn)物，具有較大的化合物發(fā)掘潛力，值得深入開展代謝潛能挖掘的研究。