趙童，孟明哲，孫棟

（焦作市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科北區(qū)，河南 焦作454000）

重癥肺部感染患者的臨床癥狀不具有典型性導致臨床無法判斷患者肺部感染的嚴重程度，進而降低治療效果，影響患者預后。 目前部分血清指標可用于診斷重癥肺部感染但診斷準確率較低[1-2]。因而， 探尋重癥肺部感染相關的分子標志物有助于提高臨床診斷效率。 研究報道指出，T 淋巴細胞在機體免疫功能調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用， 若細胞凋亡率增多可降低機體免疫力并可促進全身炎癥反應及感染性疾病的發(fā)生[3-4]。 長鏈非編碼RNA NEAT1 （Long non-coding RNA NEAT1，LncRNA NEAT1）在炎癥性疾病中呈高表達，并可參與免疫調(diào)節(jié)過程[5]。 微小RNA-495-3p（microRNA-495-3p，miR-495-3p）在脂多糖誘導的牙周膜細胞中表達下調(diào)，并可抑制細胞炎癥損傷[6]。 但NEAT1 與miR-495-3p 在重癥肺部感染患者中的表達及其臨床意義尚未可知。 本研究主要探討NEAT1 與miR-495-3p 對重癥肺部感染的診斷價值及其對T淋巴細胞凋亡的影響， 為提高重癥肺部感染的診斷準確率及治療效果提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016 年5 月至2018 年10 月本院收治的肺部感染患者95 例為研究對象，其中重癥感染患者50 例作為重癥感染組，非重癥感染患者45 例作為非重癥感染組，所有患者均符合相關診斷標準[7]。 重癥感染組中男30 例，女20 例，年齡60~75 歲，平均年齡（65.32±6.12）歲；非重癥感染組中男25 例，女20 例，年齡60~80 歲，平均年齡（68.38±7.21）歲。 選取同期于本院體檢的40 例健康志愿者為對照組，其中男20 例，女20 例，年齡60~78 歲，平均年齡（66.36±5.21）歲。 三組患者年齡、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）， 具有可比性。 本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 Trizol 試劑、 反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR 試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司；杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco 公司；CD3 試劑盒購自加拿大Stem Cell 公司；NEAT1 小干擾RNA（si-NEAT1）、亂序無意義陰性序列（si-NC）購自廣州銳博生物科技有限公司； 膜聯(lián)蛋白V （Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）細胞凋亡試劑盒購自美國Sigma 公司；RIPA 裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒、增強型化學發(fā)光試劑（ECL）購自北京全式金生物技術有限公司；兔抗人B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、B 淋巴細胞瘤-2 相關蛋白（Bax）抗體購自美國CST 公司；辣根過氧化物酶 （HRP） 標記的IgG 二抗購自美國Abcam 公司。

1.2.2 外周血T 淋巴細胞分離與培養(yǎng) 所有受試者均于入組次日清晨抽取外周靜脈血10 mL，其中5 mL 血液樣本經(jīng)3000 r/min 離心15 min，吸取血清置于離心管內(nèi)，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。 另一部分血液樣本5 mL 置于EDTA-K2 抗凝試管內(nèi)保存，進行T 淋巴細胞分離。按照CD3 試劑盒說明書進行操作， 將血血樣轉(zhuǎn)移至聚乙烯管內(nèi)（14 mL）， 加入等體積的1×RBC lysisi Buffer， 充分混勻，加入EasySep 陽性選擇混合物，充分混勻，室溫孵育15 min， 加入磁珠， 充分混勻， 室溫孵育10 min， 反復吹打2~3 次， 將試管置于磁極中放置5 min，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min 離心10 min， 棄上清，遠離磁極，加入PBS，反復吹打2~3 次，再次放入磁極中，5 min 后加入PBS 重懸細胞 （即CD3+T淋巴細胞）。

1.2.3 實驗分組 T 淋巴細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2、相對濕度95%， 待細胞生長至80%融合度時進行傳代培養(yǎng)。 重癥感染患者T 淋巴細胞接種于24 孔板，待細胞生長至80%融合度時更換為不含血清的培養(yǎng)基， 分別將si-NC、si-NEAT1 轉(zhuǎn)染至T 淋巴細胞，分別命名為si-NC 組、si-NEAT1 組， 嚴格按照Lipofectamine2000 說明書進行操作， 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細胞。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）檢測NEAT1、miR-495-3p 的表達水平 采用Trizol 法提取血清、T 淋巴細胞中的總RNA， 應用Nanodrop2000c 超微量分光光度計測定RNA 濃度。 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 NEAT1 正向引物5’-TCTGTGTGTCAAAGCAAGGC-3’，反向引物5’-AGATGCCACTGAATCACCCA-3’；miR-495-3p正向引物5’-GACGAAACAAACATGGTGCAC-3’，反向引物5’-TACCCACCATTCCCTTCTCC-3’；U6正向引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’；GAPDH 正 向 引 物 5’ -AACGGATTTG GTCGTATTG-3’， 反 向 引 物 5’ -GGAAGATGGTGATGGGATT-3’， 引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應條件：95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s， 共循環(huán)40 次。 置于ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀檢測NEAT1、miR-495-3p 的 對 表 達 量，NEAT1 以GAPDH 為 內(nèi) 參，miR-495-3p 以U6 為 內(nèi) 參， 采 用2-ΔΔCt法 計 算NEAT1、miR-495-3p 的相對表達量。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組T 淋巴細胞， 預冷PBS 清洗， 加入500 μL Binding Buffer 懸浮細胞， 依次分別加入5 μL Annexin VFITC 與5 μL PI，充分混勻，室溫避光孵育10 min，利用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 收集各組T 淋巴細胞， 加入RIPA 蛋白裂解液， 冰上裂解30 min，4 ℃條件下經(jīng)12000 r/min 離心10 min，吸取上清液。 采用BCA 法測定蛋白濃度， 嚴格按照試劑盒說明書進行操作。 取40 μg 蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻后點樣， 采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDSPAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗稀釋液（1:1000），4 ℃孵育24 h，TBST 洗滌， 加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 21.0 進行分析， 符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及兩兩比較的LSD-t 檢驗；計數(shù)資料采用檢驗；采用受試者工作特征（ROC）分析血清NEAT1、miR-495-3p 對重癥感染的診斷價值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清LncRNA NEAT1 與miR-495-3p 表達量比較 與對照組相比，非重癥感染組與重癥感染組患者血清NEAT1 的表達水平顯著升高 （P＜0.05），miR-495-3p 的 表 達 水 平 顯 著 降 低 （P ＜0.05）；與非重癥感染組相比，重癥感染組患者血清NEAT1 的表達水平顯著升高（P＜0.05），miR-495-3p 的表達水平顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組血清LncRNA NEAT1 與miR-495-3p 表達量比較(±s)

表1 各組血清LncRNA NEAT1 與miR-495-3p 表達量比較(±s)

注：與對照組相比，①P<0.05；與非重癥感染組相比，②P<0.05。

組別 n對照組非重癥感染組重癥感染組F 值P 值40 45 50 NEAT1 miR-495-3p 1.01±0.15 1.68±0.23①2.63±0.51①②247.891＜0.001 1.02±0.21 0.52±0.11①0.30±0.09①②294.474＜0.001

2.2 血清NEAT1、miR-495-3p 對重癥肺部感染的診斷價值 繪制ROC 曲線分析血清NEAT1、miR-495-3p 對重癥肺部感染的診斷價值， 結(jié)果顯示NEAT1 在重癥肺部感染診斷時敏感度為82.00%，特 異 度 為84.44%，AUC 面 積 為0.816，95%CI：0.723~0.888，截斷值為2.065；miR-495-3p 在重癥肺部感染診斷時敏感度為78.00%， 特異度為82.22%，AUC 面 積 為0.820，95%CI：0.727~0.891，截斷值為0.413，見圖1。

圖1 血清NEAT1、miR-495-3p 對重癥感染診斷的ROC 分析圖

2.3 重癥肺部感染患者T 淋巴細胞中NEAT1 與miR-495-3p 表達量比較 與對照組相比， 非重癥感染組與重癥感染組患者T 淋巴細胞中NEAT1的表達水平顯著升高（P＜0.05），miR-495-3p 的表達水平顯著降低（P＜0.05）；與非重癥感染組相比，重癥感染組患者T 淋巴細胞中NEAT1 的表達水平顯著升高（P＜0.05），miR-495-3p 的表達水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 重癥肺部感染患者T 淋巴細胞中NEAT1與miR-495-3p 表達量比較（±s，n=9）

表2 重癥肺部感染患者T 淋巴細胞中NEAT1與miR-495-3p 表達量比較（±s，n=9）

注：與對照組相比，①P<0.05；與非重癥感染組相比，②P<0.05。

組別 NEAT1對照組非重癥感染組重癥感染組F 值P 值miR-495-3p 1.00±0.18 0.63±0.11①0.35±0.10①②52.662＜0.001 1.02±0.16 1.52±0.29①2.01±0.18①②46.558＜0.001

2.4 重癥肺部感染患者T 淋巴細胞凋亡的變化與對照組相比，非重癥感染組與重癥感染組患者T淋巴細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Bax 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與非重癥感染組相比，重癥感染組患者T 淋巴細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著降低 （P＜0.05），Bax 蛋白水平顯著升高 （P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 重癥肺部感染患者T 淋巴細胞凋亡的變化

表3 重癥肺部感染患者T 淋巴細胞凋亡的變化（±s，n=9）

表3 重癥肺部感染患者T 淋巴細胞凋亡的變化（±s，n=9）

注：與對照組相比，①P<0.05；與非重癥感染組相比，②P<0.05。

組別對照組非重癥感染組重癥感染組F 值P 值細胞凋亡率（%） Bcl-2 蛋白8.57±1.35 19.25±3.24①37.58±4.16①②196.193＜0.001 0.85±0.10 0.52±0.11①0.30±0.05①②84.110＜0.001 Bax 蛋白0.46±0.03 0.68±0.12①0.96±0.15①②44.857＜0.001

2.5 沉默NEAT1 表達對重癥肺部感染患者T 淋巴細胞凋亡的影響 與si-NC 組相比，si-NEAT1 組重癥肺部感染患者T 淋巴細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著升高 （P＜0.05），Bax蛋白水平顯著降低（P＜0.05），miR-495-3p 的表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖3、表4。

圖3 沉默NEAT1 表達對T 淋巴細胞凋亡的影響

表4 沉默NEAT1 表達對T 淋巴細胞凋亡的影響（±s，n=9）

表4 沉默NEAT1 表達對T 淋巴細胞凋亡的影響（±s，n=9）

組別 細胞凋亡率（%）si-NC 組si-NEAT1 組t 值P 值36.57±5.11 16.45±3.21 10.002＜0.001 Bcl-2 蛋白 Bax 蛋白0.33±0.08 0.87±0.16 9.056＜0.001 0.95±0.17 0.42±0.10 8.062＜0.001 miR-495-3p 0.38±0.17 0.95±0.23 5.979＜0.001

3 討論

T 淋巴細胞凋亡與感染性疾病發(fā)生過程有關，并可促進自身免疫及感染的發(fā)生[8-9]。 目前，關于重癥肺部感染與T 淋巴細胞凋亡的相關分子機制尚未闡明。 因此，本研究從分子水平探究重癥肺部感染相關基因?qū) 淋巴細胞凋亡的影響及其分子機制。

NEAT1 在感染的巨噬細胞中表達上調(diào)， 并可在結(jié)核病免疫反應過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[10]。研究表明，肺結(jié)核患者外周血中NEAT1 表達水平升高，其高表達量與肺結(jié)核的發(fā)展密切相關[11]。 與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示，NEAT1 在重癥肺部感染患者血清中表達上調(diào)， 其表達量高于對照組與非重癥感染組，提示NEAT1 表達量升高可能促進肺部感染的發(fā)生及發(fā)展。 本研究通過ROC曲線分析NEAT1 對重癥肺部感染的診斷價值，發(fā)現(xiàn)其靈敏度與特異度均較高，提示NEAT1 可能作為重癥肺部感染的有效分子標志物。 研究表明NEAT1 可充當miR-495-3p 的海綿分子， 從而促進心肌缺血-再灌注損傷[12]。但NEAT1 是否可調(diào)控miR-495-3p 參與重癥肺部感染的發(fā)生過程尚未可知。 研究表明，miR-495-3p 表達異?？蓞⑴c肺纖維化、腫瘤等發(fā)生過程[13-14]。 本研究結(jié)果顯示，miR-495-3p 在重癥肺部感染患者血清中表達下調(diào)，進一步研究顯示miR-495-3p 對重癥肺部感染具有一定診斷價值， 可明顯區(qū)別重癥肺部感染與非重癥肺部感染，提示miR-495-3p 可能作為重癥肺部感染診斷及治療的潛在靶標基因。

T 細胞凋亡與增殖在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，T 淋巴細胞凋亡可促使機體免疫穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變[15]。本研究為探討重癥肺部感染患者T 淋巴細胞凋亡的原因， 采用磁珠分選方法分離重癥肺部感染患者T 淋巴細胞，結(jié)果顯示，重癥肺部感染患者T 淋巴細胞凋亡率明顯高于非重癥感染患者，Bcl-2 表達量降低，Bax 表達量升高， 說明重癥感染環(huán)境下T 淋巴細胞凋亡明顯增加， 隨著病情的加重T 淋巴細胞凋亡率也隨之升高。 提示重癥肺部感染患者外周血T 淋巴細胞數(shù)目減少可能引發(fā)免疫抑制。 同時本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，重癥肺部感染患者T 淋巴細胞中NEAT1 的表達水平明顯升高，miR-495-3p 的表達水平明顯降低， 進一步分析顯示沉默NEAT1 表達后T 淋巴細胞凋亡率明顯降低，Bcl-2 表達量顯著升高，Bax 表達量顯著降低， 提示重癥肺部感染患者可通過降低抗凋亡蛋白Bcl-2 表達及促進凋亡蛋白Bax 表達，從而增加T 淋巴細胞凋亡， 而沉默NEAT1 表達可明顯抑制T 淋巴細胞凋亡。

綜上所述，NEAT1 在重癥肺部感染患者血清中呈高表達，miR-495-3p 表達量降低， 二者對重癥肺部感染具有一定診斷價值，體外細胞實驗中，沉默NEAT1 表達可能通過上調(diào)miR-495-3p 表達從而抑制重癥肺部感染患者T 淋巴細胞凋亡，可為臨床診斷及治療重癥肺部感染提供理論依據(jù)。