劉文杰 李巧玲 馬科

肺癌是目前全球發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤,依據(jù)肺癌細胞病理類型可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)［1］,所有肺癌的5 年相對生存率僅為19%,NSCLC 的5 年生存率(23%)高于小細胞肺癌(6%)［2］。因腫瘤的隱匿性,大部分肺癌患者確診已處于疾病晚期,錯過了最佳手術(shù)時期,在諸多的治療方式中化療仍然是未來治療NSCLC 的主要手段［3］?；熢谥委煼伟┑倪^程中常伴隨食欲減退、嘔吐、骨髓抑制等毒副反應(yīng)［4］,患者因自身耐受差而影響治療效果,故而尋求中西醫(yī)結(jié)合治療。愛康方是馬科教授診治肺癌工作中從中醫(yī)學、臨床效果及現(xiàn)代醫(yī)學出發(fā)篩選出用于治療肺癌的經(jīng)驗方,在前期研究的基礎(chǔ)上本實驗將愛康方、生理鹽水通過大鼠灌胃,環(huán)磷酰胺腹腔注射一定時間,經(jīng)心臟取血［5］,取含藥血清,用不同成分的含藥血清體外干預(yù)A549 細胞一定時間,檢測A549 細胞內(nèi)Bad、Caspase-9 表達的影響,探討愛康方治療肺癌的機理。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：雄性SPF 級的Sprague-Dawley(SD)大鼠［寧夏回族自治區(qū)實驗動物中心,許可證號：SCXK(寧)2017-0001］40 只,體重(220±20)g。細胞：A549 細胞株(武漢普諾賽生命科技有限公司,中國)。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 儀器 制冰機(AF10 SCOTSMAN,美國)；去離子水儀(PALL,Purelab Plus,美國)；高速離心機(Eppendorf 公司,德國)；電子天平(Sartorius 公司,德國)；生物分光光度計(Eppendorf 公司,德國)；熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems 公司,美國)。

1.2.2 試 劑 Bad(批號：AB90435),Caspase-9(批號：AB52298),Anti-β-actin(批 號：AB179467)(abcam公司,英國)；小鼠二抗試劑盒(批號：PV-9002,北京中杉金橋公司,中國)；天根總RNA 提取試劑盒(批號：DP419,上海生工生物有限公司,中國),Bad、Caspase-9的基因引物(上海生工生物有限公司,中國)；全蛋白提取試劑盒(KGP250)、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(KGP113)、Trizol［Invitrogen(Cat# 15596-026)］(凱基生物科技發(fā)展有限公司,南京)。

1.3 藥品 愛康方藥物組成：臭殼蟲6 g(云南云南楚雄市,中國),血余炭3 g、花蕊石11 g、生薏苡仁30 g、三七6 g、通關(guān)藤30 g、金蕎麥30 g、桃仁12 g、紫珠葉30 g (寧夏明德藥業(yè)有限公司,國藥準字H32020857,中國)；環(huán)磷酰胺注射液(盛迪醫(yī)藥股份有限公司,中國)。

1.4 方法

1.4.1 藥物制備 愛康方藥物經(jīng)鑒定后濃度依據(jù)人與動物體表面積公式換算法［6］換算,水煎法濃縮制備藥液,參照前期研究結(jié)果,本實驗采用高劑量(4.74 g/ml)進行后續(xù)實驗［7］。

1.4.2 動物分組及含藥血清的制備 動物分組：40 只大鼠,采用隨機分組法分為空白對照組(NS)、環(huán)磷酰胺組(CTX)、愛康方組(AKF)和愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組(AC),每組10 只。其中愛康方組、愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組大鼠環(huán)磷酰胺按20 mg/kg 體重比例在第1、3、5 天進行腹腔注射；愛康方組、愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組灌胃給藥(濃縮藥液,1 ml/100 g,2 次/d)；空白對照組給予生理鹽水灌胃,量次同愛康方組。連續(xù)灌胃5 d,第4 天晚禁食,末次給藥后1.5～2 h 用10%水合氯醛麻醉大鼠后體表穿刺心臟取血,血液靜置待分層、離心10 min(條件：3000 r/min,4℃)、吸取上清液,封裝,56℃水浴滅活,0.22 μm 濾器過濾,同組混合并分裝,置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 細胞培養(yǎng)及分組

1.4.3.1 A549 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)A549 細胞,培養(yǎng)箱37℃,5% CO2培養(yǎng)環(huán)境,待細胞長滿瓶底的80%左右,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4.3.2 細胞分組 依據(jù)含藥血清處理細胞,將細胞分為空白對照組、愛康方組、環(huán)磷酰胺組、愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組。根據(jù)課題前期實驗結(jié)果,采用20%的含藥血清［8］(含藥血清：培養(yǎng)基=2∶8)為最佳干預(yù)濃度。

1.4.4 實時熒光定量(RT-qPCR)法檢測 A549 細胞中Bad、Caspase-9 mRNA 的表達水平 采用天根總RNA 提取試劑提取目標細胞以獲得總RNA 并進行逆轉(zhuǎn)錄。采用紅細胞裂解液(RNase-Free)ddH2O 稀釋反應(yīng)體系到50 μl,-20℃保存。用熒光定量PCR 擴增,擴增反參數(shù)為：95℃ 30 s、95℃5 s、60℃ 34 s,共40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后按照公式2-ΔΔCt計算mRNA 的含量。引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

1.4.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting 法) 測定A549 細胞中Bad、Caspase-9 蛋白的表達收集處理后的A549 細胞,提取總蛋白,BCA 蛋白濃度檢測法檢測各組蛋白質(zhì)含量；依據(jù)Bad、Caspase-9 蛋白分子量配備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠,將處理好的蛋白樣品樣電泳、轉(zhuǎn)膜；然后用5%脫脂牛奶在4℃封閉1 h 后放入一抗工作液(1∶1000)中,4℃過夜后洗膜；二抗反應(yīng)(1∶3000),室溫孕育60 min,最后洗膜、曝光及洗片；以肌動蛋白(β-actin)為對照蛋白,用image J 軟件分析灰度值,Bad、Caspase-9 與β-actin 的光密度值比值作為Bad、Caspase-9 蛋白表達的相對量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差 ()表示,采用t檢驗；多樣本均數(shù)比較采用one-way ANOVA 檢驗,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR 法檢測A549 細胞中Bad mRNA 的表達水平 48、72 h 時,環(huán)磷酰胺組、愛康方組和愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組Bad mRNA 表達水平高于空白對照組,愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組Bad mRNA 表達水平高于環(huán)磷酰胺組和愛康方組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；48 h時,環(huán)磷酰胺組Bad mRNA 表達水平高于愛康方組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；72 h 時,愛康方組Bad mRNA 表達水平與環(huán)磷酰胺組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。48、72 h 時,空白對照組與環(huán)磷酰胺組Bad mRNA 表達水平組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；72 h 時,愛康方組和愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組Bad mRNA表達水平高于本組48 h,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1-1,圖1-2,圖1-3。

2.2 RT-qPCR 法檢測A549 細胞中Caspase-9 mRNA的表達水平 48、72 h 時,環(huán)磷酰胺組、愛康方組和愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組Caspase-9 mRNA 表達水平高于空白對照組,愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組Caspase-9 mRNA 表達水平高于環(huán)磷酰胺組和愛康方組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；48 h 時,環(huán)磷酰胺組Caspase-9 mRNA 表達水平高于愛康方組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；72 h 時,愛康方組Caspase-9 mRNA 表達水平與環(huán)磷酰胺組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。48、72 h 時,空白對照組與環(huán)磷酰胺組Caspase-9 mRNA 表達水平組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；72 h 時,愛康方組和愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組Caspase-9 mRNA表達水平高于本組48 h,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1-4,圖1-5,圖1-6。

2.3 Western blot 檢測A549 細胞內(nèi)Bad 蛋白的表達48、72 h 時,環(huán)磷酰胺組、愛康方組和愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組Bad 蛋白表達水平明顯高于空白對照組,環(huán)磷酰胺組、愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組高于愛康方組,愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組高于環(huán)磷酰胺組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。72 h 時,空白對照組和環(huán)磷酰胺組Bad 蛋白表達水平與本組48 h 比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；愛康方組和愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組Bad 蛋白表達水平高于本組48 h,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖2-1,圖2-2,圖2-3。

2.4 Western blot 檢測A549 細胞內(nèi)Caspase-9 蛋白的表達 48、72 h 時,環(huán)磷酰胺組、愛康方組和愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組Caspase-9 蛋白表達水平明顯高于空白對照組,環(huán)磷酰胺組、愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組高于愛康方組,愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組高于環(huán)磷酰胺組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。72 h 時,空白對照組和環(huán)磷酰胺組Caspase-9 蛋白表達水平與本組48 h 比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；愛康方組和愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺組Caspase-9 蛋白表達水平高于本組48 h,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖2-4,圖2-5,圖2-6。

3 討論

肺癌作為全世界常見癌癥之一,其中NSCLC 約占85%,而小細胞肺癌僅占15%［9］。NSCLC 的治療具有階段性,其中Ⅰ期或Ⅱ期的患者在無禁忌證的前提下行手術(shù)切除治療,非手術(shù)患者則應(yīng)考慮采用常規(guī)或立體定向放射治療［10］?；焺t成為了不可或不能切除腫瘤者治療方式的主要選擇之一［11］。但考慮到部分NSCLC 患者對化療治療存在化療耐藥性,導(dǎo)致化療后NSCLC 的復(fù)發(fā)率仍偏高［12］。與此同時在癌癥常規(guī)治療中,抗腫瘤藥物也常會導(dǎo)致血象改變、貧血、血管疾病、肝損傷和肺部疾病及許多皮膚病表現(xiàn)［13］。中醫(yī)藥與化療藥物配合在一定程度上能增強治療作用,緩解相關(guān)不良反應(yīng),改善化療后不適感［14］。單味中藥和中藥復(fù)方在防治或延緩NSCLC 耐藥方面有一定的作用［15］。實驗證明,中藥扶正祛邪復(fù)方對多藥耐藥性有逆轉(zhuǎn)效果,并對白血病細胞產(chǎn)生了抑制作用［16］。

肺癌在中醫(yī)學角度常被認為是正虧邪侵,正邪相互搏結(jié),痰瘀交結(jié)所致［17］。塞上名醫(yī)馬科教授治療肺癌的實效經(jīng)驗組方愛康方,功主清熱解毒、消瘀散結(jié),從病因?qū)Ψ伟┻M行治療。方以金蕎麥為君藥取其解毒祛瘀,清熱排膿之意；通關(guān)藤合紫珠葉,功善活血散腫、止咳平喘、除熱解毒,增強金蕎麥解毒、排膿抗癌之力,共為臣藥；花蕊石、血余炭、三七、桃仁在祛瘀活血同時兼止血,祛中有收,共為佐藥；薏苡仁健脾滲濕,合君藥取培土生金之意,唯一蟲類藥臭殼蟲功可解毒散結(jié),共為使藥。藥理學研究證明,金蕎麥中的優(yōu)效組分異鼠李素能上調(diào)Bax、Caspase-3 的表達,下調(diào)Bcl-2、cyclinD1 和PCNA 蛋白的表達,誘導(dǎo)肺癌A549細胞凋亡［18］；通關(guān)藤能通過促進凋亡相關(guān)蛋白、下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-2、VEGF-A、白細胞介素-10(IL-10)和丙二醛(MDA)等達到抗腫瘤作用［19］。學者從大葉紫珠分離出的化合物能HepG-2、MCF-7細胞株產(chǎn)生抑制作用［20］?；ㄈ锸苷T導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡、抑制增殖,其效果跟藥物劑量和作用時間有著密切關(guān)系［21］；桃仁提取物可以調(diào)控炎癥因子、調(diào)解血脂［22］,亦能效防治和控制血瘀證的發(fā)生［23］。

細胞凋亡是由基因控制的自主有序死亡,部分抗腫瘤藥物則通過誘導(dǎo)細胞凋亡方式以達到治療腫瘤目的。BH3-Only 蛋白Bad 是Bcl-2 家族的成員,具有促凋亡蛋白的特性。去磷酸化的Bad 轉(zhuǎn)位到線粒體膜上,在線粒體膜上結(jié)合并失活(Bcl-2 和Bcl-xl)抗凋亡蛋白。Bad 表達量的高低與癌癥患者的預(yù)后緊密相關(guān)。因此,Bad 在連接細胞生存信號通路和凋亡信號通路中作用不可或缺［24］。Caspase 是一種半胱氨酸酶或天冬氨酸蛋白酶,是一種內(nèi)源性細胞凋亡啟動者,調(diào)節(jié)生理性細胞死亡和病理組織退變。啟動子Caspase(Caspase-1、-2、-8、-9、-10)與激活平臺結(jié)合后通過二聚化激活,再通過蛋白水解性切割激活下游效應(yīng)Caspase(如Caspase-3、-6 和-7),進而激活更多的啟動子Caspase。而Caspase-9 活化發(fā)生在凋亡小體中,由凋亡蛋白酶激活因子1 (Apaf-1)和細胞色素c組成的低聚物結(jié)構(gòu),其能使線粒體外膜通透性改變,并將細胞色素c 的釋放進入細胞質(zhì)。Caspase-9 可以激活效應(yīng)分子Caspase,或通過Caspase-9 裂解基序包圍天冬氨酸殘基裂解靶蛋白。Caspase-9 活化最典型的結(jié)果是下游效應(yīng)物Caspase 的裂解,從而誘導(dǎo)凋亡細胞死亡［25］。

RT-qPCR 檢測Bad、Caspase-9 mRNA 的表達,表明愛康方在基因水平與環(huán)磷酰胺起到協(xié)同作用,從而促進腫瘤細胞凋亡；Western blot 從蛋白表達定量的角度進一步表明愛康方聯(lián)合環(huán)磷酰胺能上調(diào)促凋亡蛋白Bad、Caspase-9 的表達,從而起到抗腫瘤生長作用。

綜上所述,愛康方能抑制肺癌腫瘤生長,與環(huán)磷酰胺合用抑癌效果更佳,可能是通過上調(diào)A549 細胞中促凋亡蛋白Bad、Caspase-9,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而實現(xiàn)的。