唐亮，唐名艷，潘志新，蔣滿貴，趙燁蕓，余武昌，李標(biāo)，虞崇江，董桂清*

（1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站，南寧市 530007；2.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院，南寧市 530007）

廣西是全國蠶桑產(chǎn)業(yè)大省（區(qū)），在承接“東桑西移”的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)移中，逐漸形成了以小蠶共育及多批次連續(xù)養(yǎng)蠶為特點的廣西高密度養(yǎng)蠶模式，為蠶繭產(chǎn)量提升提供了有力保障，使廣西成為了全國乃至世界重要的桑蠶繭絲生產(chǎn)基地。但廣西高溫多濕氣候以及連續(xù)養(yǎng)蠶的飼養(yǎng)模式，更易多發(fā)生物病原繁殖與感染從而引發(fā)病害。據(jù)不完全統(tǒng)計，廣西蠶桑生產(chǎn)中由發(fā)生蠶病造成的蠶繭損失15%～20%。

家蠶血液型膿病又稱家蠶核型多角體?。˙ombyx moriNuclearpolyhedrosis Virus NPV，簡稱BmNPV），是危害家蠶最嚴(yán)重的一種病毒病，僅2008—2018 年廣西家蠶膿病年均發(fā)生率為11.35%，使之成為廣西最為嚴(yán)重的傳染性蠶病之一［1-2］，每年損失蠶繭達數(shù)萬噸。其病毒是一種有包涵體的DNA 病毒［3］，對蠶座血液型膿病次生感染進行調(diào)查情況，有助于解析家蠶病毒病傳播的關(guān)鍵要素，服務(wù)蠶桑產(chǎn)業(yè)蠶病防控。基于家蠶血液型膿病對蠶桑產(chǎn)業(yè)的巨大危害，精準(zhǔn)防控該病成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點和難點。王霞等［4］通過對廣西不同蠶區(qū)來源的15 株BmNPV毒株進行測定，其對家蠶品種兩廣二號的LC50多角體濃度2.1×106～4.2×106個/mL，屬于抗性較高水平，但毒株間差異不顯著。在前期蠶病普查研究中發(fā)現(xiàn)，廣西河池地區(qū)血液型膿病的發(fā)病率與季節(jié)、蠶區(qū)有緊密的相關(guān)性，如夏季的6—8 月血液型膿病顯著高于其他月份；氣溫高和降雨多的蠶區(qū)血液型膿病年均發(fā)生率高，如貴港蠶區(qū)夏季發(fā)病率為18.15%，危害嚴(yán)重［2］。

偏相關(guān)分析是指當(dāng)兩個變量同時與第三個變量相關(guān)時，將第三個變量的影響剔除，只分析另外兩個變量之間相關(guān)程度的過程，判定指標(biāo)是相關(guān)系數(shù)的R值，是目前使用較多的一種分析工具。影響家蠶血液型膿病的因子較多，對傳染因子進行偏相關(guān)分析可以實現(xiàn)精準(zhǔn)防控該病，抓住主要影響因子。韋秉興等［5］2008 年報道將5%BmNPV 的兩廣二號病蠶混入不同飼養(yǎng)密度的5齡蠶群體，觀察膿病二次感染的發(fā)生率。結(jié)果顯示，909 頭/m2的飼養(yǎng)密度膿病發(fā)病率高達68.40%，但其試驗設(shè)計中，傳染因子種類設(shè)置較少，在蠶座傳染試驗設(shè)計上，混育群體數(shù)量較少，數(shù)據(jù)處理采用回歸統(tǒng)計分析，未進行偏相關(guān)分析。而在絲繭育養(yǎng)蠶過程中，養(yǎng)蠶群體較大，傳染影響因子較多，氣候、飼育密度、混育病蠶數(shù)等對發(fā)病率可能有較大影響。

血液型膿病的高發(fā)生率通常被認(rèn)為是病蠶在蠶座中發(fā)生了二次感染導(dǎo)致（也稱次生傳染），但低齡蠶期感染病原形成的次生傳染規(guī)律及防控措施有效性等鮮有報道。小蠶共育是廣西蠶桑生產(chǎn)中常見的飼育形式，將蠶兒共育至3齡餉食后售賣，3齡第二口葉轉(zhuǎn)由農(nóng)戶飼養(yǎng)。如共育的小蠶存在血液型膿病感染，那么膿病感染率對大蠶飼養(yǎng)產(chǎn)生何種影響尚未可知?；谝陨蠁栴}，本研究對不同氣候條件、飼養(yǎng)密度、病蠶比例、藥物處理等血液型膿病傳染因子進行調(diào)查分析，為防控家蠶血液型膿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

測試病原來源于廣西河池蠶區(qū)，從發(fā)病膿蠶中分離制備多角體病毒，4.0 ℃保存?zhèn)溆?。供試家蠶品種為兩廣二號?；烊氩≡Q的制備方法：分別在混入病蠶前84 h、96 h、108 h 在桑葉上涂抹濃度為5×108個/mL 病毒多角體并連續(xù)添食，在同期兩廣二號正常蠶起蠶第二口葉時，挑選出有典型膿病癥狀的病蠶（比如在蠶座中表現(xiàn)狂躁、體色乳白、高節(jié)、亂爬的蠶），用馬克筆標(biāo)記，作為測試混入源病蠶。Tris、NaCl、EDTA、SDS、TritonX 等試劑為滬試，家蠶核型多角體（RAA）快速檢測試劑盒由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站及南寧眾測有限公司聯(lián)合研發(fā)。

1.2 不同飼養(yǎng)氣候環(huán)境混入不同比例病蠶條件下家蠶血液型膿病蠶座內(nèi)次生傳染率測定

在實驗室模擬廣西蠶區(qū)春、夏、秋季的溫濕度氣候環(huán)境，設(shè)置春季（25℃和85%RH）、夏季（33℃和90%RH）、秋季（30℃和80%RH）3 個處理，設(shè)空白對照組，每個處理100頭（供試健康蠶+混入病蠶=100），每個處理3 個重復(fù)。在三齡起蠶第二口葉各個處理分別混入3%、5%、10%等不同比例的病蠶，混入病蠶30 min后正常喂葉，然后按飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)至上蔟，調(diào)查蠶期病死蠶、上蔟后第5 d（化蛹后2 d）死籠率情況。病死蠶核定采用常規(guī)鏡檢復(fù)核和重組酶介導(dǎo)鏈（RAA 法）復(fù)核相結(jié)合的方式，精準(zhǔn)確定血液型膿病次生傳染病蠶數(shù)量。

1.3 不同飼養(yǎng)密度環(huán)境混入不同比例病蠶條件下蠶座內(nèi)家蠶血液型膿病次生傳染率測定

在實驗室模擬低密度、標(biāo)準(zhǔn)密度、高密度3 個不同飼養(yǎng)密度，在標(biāo)準(zhǔn)密度基礎(chǔ)上降低33.3%為低密度，在標(biāo)準(zhǔn)密度基礎(chǔ)上提高33.3%即為高密度。根據(jù)地方標(biāo)準(zhǔn)推薦密度作為標(biāo)準(zhǔn)密度，3～5齡3個齡期飼養(yǎng)密度分別定為8 000 頭/m2、3 500 頭/m2、750 頭/m2，在各齡起蠶第二口葉后設(shè)定為各齡間密度轉(zhuǎn)換節(jié)點。

設(shè)低密度、標(biāo)準(zhǔn)密度、高密度3個處理，設(shè)空白對照組。在三齡起蠶第二口葉各個處理分別混入3%、5%、10%等不同比例的病蠶，按照設(shè)定密度條件飼養(yǎng)至上蔟，試驗設(shè)計和調(diào)查方法參照1.2執(zhí)行。

1.4 不同齡期混入不同比例病蠶條件下蠶座內(nèi)群體家蠶血液型膿病次生傳染發(fā)病率測定

設(shè)3 齡混入病蠶、4 齡混入病蠶、5 齡混入病蠶3個處理，設(shè)空白對照組。3 齡期起蠶第二口按3%、5%、10%比例的混入病蠶。試驗設(shè)計、飼養(yǎng)和調(diào)查方法參照1.2執(zhí)行。

1.5 混入不同比例病蠶條件下用不同藥物處理對家蠶血液型膿病蠶座內(nèi)次生傳染率測定

在實驗室模擬的秋季環(huán)境及標(biāo)準(zhǔn)密度條件下，設(shè)置新鮮石灰粉、“蠶康1 號”、風(fēng)化石灰粉3 個藥物處理及陽性和空白對照組。每個處理100頭（供試健康蠶+混入病蠶=100），每個處理3個重復(fù)。在三齡起蠶第二口葉各個處理區(qū)分別混入3%、5%、10%等不同比例的病蠶，分別用新鮮石灰粉、蠶康1號、風(fēng)化石灰粉等3種藥物進行蠶體蠶座消毒，每天喂蠶前分別進行蠶體蠶座消毒1次直至上蔟，陽性對照混入病蠶后不用藥物處理。飼養(yǎng)和調(diào)查方法參照1.2執(zhí)行。

新鮮石灰粉制備：塊狀生石灰與水混合質(zhì)量比約為1.0∶0.8，放置自然冷卻后，將石灰粉過篩密封備用。

自然風(fēng)化石灰制備：將生石灰暴露于在空氣中，待形成松散的白色粉末，收集備用。

1.6 家蠶核型多角體病毒（BmNPV）感染復(fù)核

1.6.1 BmNPV鏡檢復(fù)核 將血液型膿病典型癥狀死蠶，加入等質(zhì)量的蒸餾水，用小型勻漿器勻漿，吸取少量勻漿液至載玻片上，用2倍檢測液體積的50%乙醇處理1 min，制成樣品，16×40 倍光學(xué)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)病毒多角體，則記錄為病毒再感染蠶體。否則采用RAA 快速檢測試劑盒（杭州眾測生物科技有限公司）進行檢查復(fù)核。

1.6.2 BmNPV 的RAA 快速檢測復(fù)核 將未見血液型膿病典型癥狀死蠶，取病死蠶勻漿（方法同1.6.1），加入檢測液3 倍體積的裂解液（100 mM Tris-HCl pH 8.0，10 mM EDTA pH 8.0，2.0 M NaCl，0.1 M Na2CO3，1%SDS，0.1 mg/mL RnaseA），振蕩混勻，常溫孵育5～8 min 釋放DNA，吸取上清液待用，作為RAA核酸檢測的DNA樣本。

按照家蠶血液型膿病核酸測試劑盒（RAA 熒光法）使用說明進行測試。每次測試分別用目標(biāo)基因DNA質(zhì)粒和蒸餾水設(shè)置陽性對照與陰性對照。

1.7 數(shù)據(jù)矯正與分析

對測定所得數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 的“單因素ANOVA 檢驗”進行顯著性分析，“偏相關(guān)”進行因子相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氣候環(huán)境混入不同比例病蠶蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病情況分析

在不同溫濕度（模擬不同季節(jié)）飼養(yǎng)環(huán)境混入不同比例病蠶，蠶期及蛹期第5天血液型膿病發(fā)生結(jié)果（圖1）?；烊?%的病蠶，蠶期發(fā)病率為春季22.68%＜秋季29.55%＜夏季40.20%，差異達到極顯著水平；蛹期血液型膿病發(fā)病率也呈春季（25℃和85%）10.65%＜秋季（30℃和80%）13.75%＜夏季18.90%趨勢，發(fā)病率隨溫濕度升高而增大，其中夏季與春季、秋季的差異均達到顯著水平?；烊?%、10%的病蠶發(fā)病率也呈現(xiàn)同樣趨勢。預(yù)示著在蠶群體中已有個體被感染情況下，高溫多濕環(huán)境是誘導(dǎo)和加快蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病的重要因子，與實際生產(chǎn)中6—8月家蠶血液型膿病率高相吻合。

從圖1 還可看出，秋季混入3%、5%、10%不同比例病蠶時，蠶期蠶座內(nèi)次生發(fā)病率分別為29.55%、45.96%、63.33%，差異達顯著水平；蛹期發(fā)病率也分別達13.75%、19.65%、19.63%。春季、夏季混入不同比例病蠶發(fā)病率也有類似趨勢，表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強的蠶座內(nèi)群體次生傳染力，混入感染病蠶個體比例越高，蠶期及蛹期次生傳染發(fā)病越嚴(yán)重。因此，家蠶血液膿病防控應(yīng)重視減少源頭病原的感染與防控。

圖1 不同氣候環(huán)境混入不同比例的蠶座內(nèi)血液型膿病次生傳染率

2.2 不同飼養(yǎng)密度混入不同比例病蠶蠶座內(nèi)群體次生傳染發(fā)病情況分析

家蠶不同飼養(yǎng)密度混入不同比例病蠶，蠶期及蛹期第5 天血液型膿病發(fā)生結(jié)果見（圖2）?；烊?%的病蠶，蠶期發(fā)病率呈現(xiàn)低密度25.09%＜標(biāo)準(zhǔn)密度29.21%＜高密度35.40%趨勢，高密度與標(biāo)準(zhǔn)密度、低密度差異達到顯著水平；標(biāo)準(zhǔn)密度發(fā)病率雖然高于低密度，但未達到顯著水平。蛹期發(fā)病率也呈低密度9.28%＜標(biāo)準(zhǔn)密度12.37%＜高密度15.12%趨勢，發(fā)病率隨密度升高而增加，但差異不顯著。混入5%、10%病蠶發(fā)病率也呈現(xiàn)類似趨勢。該結(jié)果表明家蠶血液型膿病蠶座內(nèi)群體次生傳染發(fā)病與蠶座密度有密切關(guān)系，蠶座密度越大，次生傳染發(fā)病率越高，推測原因是因為蠶頭密度過高，家蠶食下病毒污染葉的機會較大，還有蠶胸、腹足勾爪相互抓傷，增加病毒創(chuàng)傷感染的機率，同時蠶頭密度過高增加健康蠶與病蠶接觸的概率，增加傳染風(fēng)險。

從圖2還可看出，低密度（標(biāo)準(zhǔn)密度降低33.3%）混入3%、5%、10%不同比例病蠶時，蠶期蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病率分別為25.09%、38.60%、54.07%，差異達顯著水平；蛹期發(fā)病率也分別達9.28%、12.98%、14.07%，混入10%病蠶與混入3%病蠶的差異達到顯著水平。標(biāo)準(zhǔn)密度、高密度混入不同比例病蠶其發(fā)病率也呈現(xiàn)類似趨勢。該結(jié)果進一步表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強的蠶座傳染，混入感染病蠶個體越多，蠶期及蛹期次生傳染發(fā)病越嚴(yán)重。

圖2 不同飼養(yǎng)密度混入不同比例病蠶蠶座中血液型膿病次生傳染率

2.3 不同齡期混入不同比例病蠶蠶座內(nèi)群體次生傳染發(fā)病情況分析

不同齡期混入不同比例病蠶，蠶期及蛹期第5 d血液型膿病發(fā)生結(jié)果見圖3?；烊?%的病蠶，蠶期發(fā)病率呈現(xiàn)5 齡（11.00%）＜4 齡（18.90%）＜3 齡29.55%趨勢，差異達到顯著水平；蛹期發(fā)病率5 齡（4.47%）＜4齡（11.00%）＜3齡（13.75%），其中3齡混入與5 齡混入的發(fā)病率差異達到顯著水平?；烊?%、10%的病蠶其發(fā)病率也呈現(xiàn)類似趨勢。預(yù)示著家蠶血液型膿病蠶座內(nèi)群體次生傳染發(fā)病與蠶被感染齡期有密切關(guān)系，被感染齡期越小，次生傳染發(fā)病率越高。

從圖3 還可看出，3 齡期混入3%、5%、10%病蠶時，蠶期蠶座內(nèi)次生發(fā)病率分別為29.55%、45.96%、63.33%，差異達顯著水平；蛹期發(fā)病率也分別達13.75%、16.49%、19.63%，其中混入10%病蠶與混入3%病蠶其發(fā)病率差異達顯著水平。4齡期、5齡期混入不同比例病蠶其發(fā)病率也有類似趨勢。該結(jié)果進一步表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強的蠶座內(nèi)群體次生傳染發(fā)病，只要有傳染源存在，就會形成傳播鏈，迅速傳播感染，蠶齡期越小，次生傳染發(fā)病率越高。

圖3 不同齡期混入不同比例病蠶蠶座中血液型膿病累計發(fā)生曲線

2.4 混入不同比例病蠶后不同藥物處理對蠶座內(nèi)群體次生傳染發(fā)病情況分析

不同藥物處理蠶期及蛹期第5 d 血液型膿病防控效果結(jié)果見圖4。在3 齡混入病蠶后，不同藥物處理的防控效果表現(xiàn)為新鮮石灰粉80.24%＞“蠶康1號”67.44%＞自然風(fēng)化石灰粉41.86%，差異達顯著水平。4齡、5齡混入病蠶后，不同藥物處理也呈現(xiàn)類似趨勢。該結(jié)果表明防控藥物介入可降低次生傳染發(fā)病率，但不同藥物防控效果不一樣，如本試驗中新鮮石灰粉和“蠶康1 號”兩種藥物均能顯著降低血液型膿病發(fā)病率。

從圖4 還可看出，新鮮石灰粉防控效果，呈現(xiàn)混入3%病蠶（80.24%）＞混入5%病蠶（51.91%）＞混入10%病蠶（49.12%）的趨勢，差異達到顯著水平?！靶Q康1 號”、風(fēng)化石灰粉防控效果也呈現(xiàn)類似趨勢。該結(jié)果表明隨著蠶群體內(nèi)被感染病蠶個體增加，形成多點不同時期發(fā)病的多條傳播鏈，如果每天只施用1次的藥物處理，難以有效切斷傳播鏈。因此，在生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)血液型膿病感染發(fā)病后，應(yīng)注意觀察蠶的發(fā)育情況，及時撿出病死蠶并增加施用藥物次數(shù)，以提升防控效果。

圖4 不同病蠶混入、不同藥物處理的蠶座血液型膿病防控效果曲線

2.5 各影響因子與群體中血液型膿病次生傳染發(fā)病的偏相關(guān)分析

利用SPSS 25.0 對各測試因素進行偏相關(guān)分析，獲得的數(shù)據(jù)顯示（表1），相關(guān)性最高的為“病蠶比例”，為0.603，其次是“混入齡期（時長）”，為0.393，第三是“藥物處理”，為-0.381，之后是“飼養(yǎng)季節(jié)”，為0.232和“飼養(yǎng)密度”，為0.221。即影響家蠶群體血液型膿病次生感染的首要因素是病蠶混入比例，其次是起始感染齡期，第三是藥物處理。其中前兩者顯著正相關(guān)，而藥物處理呈顯著負(fù)相關(guān)。

表1 不同因子與家蠶群體血液型膿病發(fā)病率的偏相關(guān)分析

3 討論

本研究通過蠶座中病血液型膿病次生感染情況，探究不同因子對家蠶“兩廣二號”發(fā)病情況的影響，明確該病在蠶座中的傳染規(guī)律。

在不同氣候（模擬不同季節(jié)），混入同一比例的病蠶，蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)春季＜秋季＜夏季的趨勢，差異達到極顯著水平，在蠶群體內(nèi)已有個體被感染情況下，高溫多濕環(huán)境是誘導(dǎo)和加快蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病的主要因子，在生產(chǎn)上也得到了證實［2，4，6］。

在同一氣候環(huán)境下，蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)混入病蠶比例越高發(fā)病率越高的趨勢，差異達顯著水平。表明家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強的蠶座內(nèi)群體次生傳染力，混入感染病蠶個體比例越高，次生傳染發(fā)病越嚴(yán)重，偏相關(guān)分析其與發(fā)病率的相關(guān)系數(shù)最高，表明控制病蠶數(shù)量應(yīng)是血液型膿病早期防控中最重要的環(huán)節(jié)。

不同飼養(yǎng)密度飼養(yǎng)條件下，混入同一比例的病蠶，蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)低密度＜標(biāo)準(zhǔn)密度＜高密度的趨勢，高密度與標(biāo)準(zhǔn)密度和低密度差異達到顯著水平，但相關(guān)系數(shù)在所測影響因子中排名最后。表明家蠶血液型膿病蠶座內(nèi)群體傳染與蠶座密度有一定關(guān)系，過密的蠶座使血液型膿病傳染發(fā)病率更加嚴(yán)重，生產(chǎn)上也存在這種趨勢［5，7］。

不同齡期混入病蠶的試驗中，蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病率呈現(xiàn)出5 齡＜4 齡＜3 齡的趨勢，差異達顯著水平，且偏相關(guān)性分析顯示相關(guān)系數(shù)僅次于病蠶混育率。表明家蠶群體血液型膿病次生傳染發(fā)病率與被感染齡期有密切關(guān)系，齡期越大發(fā)病越少，表明蠶病防控中應(yīng)重視小蠶期的病原清除與隔離，以降低血液型膿病危害。

不同藥物對病蠶混育率的防控效果有差異，防控效果新鮮石灰粉＞蠶康1號＞自然風(fēng)化石灰粉，偏相關(guān)分析差異達顯著水平，表明防控藥物介入可降低次生傳染發(fā)病率，但不同藥物防控效果不一樣，如本試驗中新鮮石灰粉和蠶康1 號兩種藥物均能顯著降低血液型膿病發(fā)病率［8］。

在相同藥物處理條件下，隨著初始混入病蠶比例增加，防控效果呈現(xiàn)下降的趨勢，偏相關(guān)分析差異達到顯著水平，表明隨著蠶群體內(nèi)被感染病蠶個體比例增加，多點散發(fā)不同時期發(fā)病的多條傳播鏈，如果每天只施用1次藥物，很難完全有效切斷所有傳播鏈，會出現(xiàn)病原“逃逸”現(xiàn)象，增加擴散傳染的風(fēng)險，所以在藥物防治上，增加施用次數(shù)能夠減輕危害。

4 結(jié)論

通過對廣西地區(qū)“兩廣二號”血液型膿病傳染因子進行研究并且首次采用偏相關(guān)分析，認(rèn)為，蠶群體內(nèi)有病蠶，高溫多濕環(huán)境是誘導(dǎo)和加快蠶座內(nèi)次生傳染發(fā)病的主要因子；家蠶血液型膿病呈現(xiàn)很強的蠶座內(nèi)群體次生傳染力，群體中病蠶比例越高，蠶座傳染越嚴(yán)重；蠶座密度越高，次生傳染發(fā)病率隨之提升；家蠶群體血液型膿病次生傳染發(fā)病率與被感染齡期有密切關(guān)系。偏相關(guān)分析結(jié)果顯示，病蠶混育率是最主要的影響因子，其次是混育齡期，第三是使用藥物，第四是飼養(yǎng)季節(jié)，最后是飼養(yǎng)密度。每天施用一次藥物仍然會出現(xiàn)病原逃逸的現(xiàn)象，宜增加施藥次數(shù)減輕危害。