史聰 張海利 許婷 樊慧娟

目前分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME)的病因尚不明確，變態(tài)反應(yīng)對(duì)OME的影響是近年來(lái)研究熱點(diǎn)[1，2]。有研究通過(guò)鼓膜注入卵清蛋白(ovalbumin，OVA)成功構(gòu)建OME小鼠模型，支持中耳接觸變應(yīng)原激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)，最終誘發(fā)中耳積液的產(chǎn)生，甚至提出OME是一種變態(tài)反應(yīng)[3,4]。然而，中耳通過(guò)咽鼓管與外界相通，通過(guò)上呼吸道途徑才最貼近其正常病理生理過(guò)程。有研究[5]首次觀察到經(jīng)上呼吸道OVA誘導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎小鼠模型中約12.5%產(chǎn)生中耳積液。變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR)作為上呼吸道變態(tài)反應(yīng)疾病中最常見(jiàn)的疾病[6]，常與中耳炎并發(fā),AR患者是分泌性中耳炎的高危群體,其中合并分泌性中耳炎的發(fā)病率約為5%～80%[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)OME存在與變應(yīng)性鼻炎相似的“Th1/Th2細(xì)胞失衡”，從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大炎癥反應(yīng)[2,9]。故本研究通過(guò)上呼吸道致敏的方式構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型，觀察I型變態(tài)反應(yīng)對(duì)中耳的病理生理影響，并探討變態(tài)反應(yīng)中細(xì)胞因子IL-5[10]在中耳組織中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇SPF級(jí)BALB/c小鼠(雌性、4～6周齡)18只，稱重約17.45～18.60 g，隨機(jī)分為隨機(jī)分為對(duì)照組A組、實(shí)驗(yàn)組B組、實(shí)驗(yàn)組C組，每組6只(12耳)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型的建立 采用OVA全身基礎(chǔ)致敏和滴鼻致敏的方式[5,11,12]構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型。將100 μg OVA+1 mg AL(OH)3佐劑溶解于PBS 0.2 ml，第1、8、15天將0.2 ml該溶液腹腔注射于實(shí)驗(yàn)組B組和實(shí)驗(yàn)組C組小鼠體內(nèi)，注射1次；第16日起，將10 mg/mlOVA每日1次、每側(cè)20 μl局部滴鼻。對(duì)照組A組腹腔注射和鼻部激發(fā)均使用PBS替代；實(shí)驗(yàn)組B組在基礎(chǔ)致敏中給予1 mg/ml OVA和AL(OH)3的混合液，自16日起鼻部激發(fā)至第29日，第30日處死; 為觀察AR對(duì)中耳的影響，實(shí)驗(yàn)組C組在基礎(chǔ)致敏中同法給予1 mg/ml OVA和AL(OH)3的混合液，自16日起鼻部激發(fā)至第43日，第44日處死。

1.2.2AR動(dòng)物模型的評(píng)價(jià) 根據(jù)變應(yīng)性鼻炎典型的臨床癥狀(即鼻癢、打噴嚏和鼻腔分泌物)的嚴(yán)重程度評(píng)估AR 動(dòng)物模型[13]。每次完成鼻部激發(fā)10分鐘后觀察BALB/c小鼠行為特征，并對(duì)變應(yīng)性鼻炎典型癥狀進(jìn)行評(píng)分。記錄時(shí)間自鼻部激發(fā)開(kāi)始，行為癥狀評(píng)分記錄四周，每次指定同一時(shí)間段及同一人進(jìn)行評(píng)分，評(píng)估總分達(dá)5分及以上便可視為AR小鼠動(dòng)物模型建模成功。記分方法：①鼻癢:0分-無(wú)；1分-搔鼻2次/分；2分-搔鼻4～6次/分；3分-搔鼻>6次/分；②打噴嚏:0分-無(wú)；1分-1～3次/10分；2分-4～9次/10分；3分>10次/10分；③鼻黏液:0分-無(wú)；1分-在鼻腔里；2分-流出鼻腔外；3分-涕流滿面。

1.2.3中耳組織的觀察指標(biāo) 中耳的評(píng)價(jià)指標(biāo)有[14]：①觀察鼓膜象的改變；②中耳組織的病理改變；③中耳積液的性質(zhì)；以出現(xiàn)中耳積液判斷為OME。

1.2.4血清IgE表達(dá)水平檢測(cè) 小鼠5%水合氯醛麻醉后，眼眶后靜脈叢取血。離心機(jī)室溫離心15 min，轉(zhuǎn)速為3 000轉(zhuǎn)/分，15 min后收集上清，ELISA試劑盒檢測(cè)IgE的表達(dá)水平。

1.2.5鼻黏膜及聽(tīng)泡組織的采集 小鼠處死后，剝離頭部皮膚，剪除外鼻，暴露頭骨、鼻骨及聽(tīng)泡等，置于裝有PBS的培養(yǎng)皿中。自鼻后孔沖洗鼻腔，于鼻中隔處正中矢狀位處剪切開(kāi)，翻開(kāi)可見(jiàn)淡黃色的鼻腔黏膜，剝離及沖洗后置于4%多聚甲醛中固定4小時(shí)。將聽(tīng)泡周?chē)M織、肌肉分離剪除干凈，摘取聽(tīng)泡及咽鼓管骨段，EDTA脫鈣液脫鈣完全，PBS清洗后于4%多聚甲醛中過(guò)夜固定[15]。

1.2.6鼻黏膜及聽(tīng)泡組織HE染色及中耳黏膜厚度測(cè)量 將鼻黏膜及聽(tīng)泡的石蠟包塊在-20℃冰箱預(yù)先保存30 min，切成均勻3 μm厚度粘附于載玻片上，置于攤片烤片機(jī)(恒溫65℃)約150 min，經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 各10 min脫蠟，梯度酒精從高至低水化，蘇木精染色40 s-自來(lái)水清洗-1%酒精瞬時(shí)分化10 s-伊紅染色40 s-自來(lái)水清洗。順酒精梯度及二甲苯從低到高脫水后充分干片后中性樹(shù)膠封片。中耳組織切片時(shí)與鼓膜垂直，每塊組織同一位置連續(xù)切3片，同部位重復(fù)測(cè)量3次取平均值。中耳鼓室黏膜有三種細(xì)胞類(lèi)型：?jiǎn)螌颖馄缴掀?；扁平上?被覆纖毛)以及假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮。在距咽鼓管由近及遠(yuǎn)測(cè)量近咽鼓管黏膜、中段中耳鼓室黏膜、鼓膜緊張部3處的中耳黏膜厚度(圖1)。

1.2.7免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)IL-5在鼻黏膜及中耳骨髓腔中的表達(dá) 鼻黏膜及聽(tīng)泡石蠟塊切片、烤片、以及脫蠟水化，將切片置于現(xiàn)配置的盛有檸檬酸鹽的高壓鍋中，高溫加熱2 min后冷卻、浸洗；3%H2O2甲醇溶液避光玻璃器皿里孵育10 min；浸洗畫(huà)圈后于濕盒滴加二抗同源的山羊血清室溫孵育(預(yù)實(shí)驗(yàn)得出兔抗鼠IL-5多克隆抗體稀釋為1∶400)。20 min后一抗孵育4℃過(guò)夜。復(fù)溫、二抗孵育30 min，浸洗后滴加二抗增強(qiáng)液37℃孵育；30 min后DAB顯色顯微鏡下觀察組織顯色情況；最終封片后切片掃描后進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1AR動(dòng)物模型構(gòu)建結(jié)果 各組小鼠鼻部激發(fā)不同時(shí)期行為癥狀學(xué)評(píng)分見(jiàn)表1，可見(jiàn)，對(duì)照組A小鼠四周內(nèi)日?；顒?dòng)正常，僅偶爾出現(xiàn)滴鼻后刺激性的搔鼻和打噴嚏，無(wú)流涕癥狀，每日評(píng)分為0～1分；實(shí)驗(yàn)組B組小鼠耳部激發(fā)第一周出現(xiàn)搔鼻、打噴嚏，未見(jiàn)流涕，癥狀評(píng)分5.29±0.7分，第二周小鼠搔鼻及打噴嚏次數(shù)較前頻繁，癥狀評(píng)分5.31±0.75分；癥狀評(píng)分>5分，變應(yīng)性鼻炎模型構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)組C組小鼠鼻部激發(fā)第一周至第四周內(nèi)均出現(xiàn)搔鼻、打噴嚏、鼻內(nèi)流涕，且觀察時(shí)間內(nèi)可見(jiàn)2～3只小鼠出現(xiàn)搔耳朵行為，四周癥狀評(píng)分均>5分，變應(yīng)性鼻炎模型構(gòu)建成功。

表1 各組小鼠不同觀察時(shí)期行為癥狀學(xué)評(píng)分(分，

滴鼻第1、2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組B、C組與對(duì)照組A癥狀學(xué)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，滴鼻第3、4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組C組與對(duì)照組A組癥狀學(xué)評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示實(shí)驗(yàn)組B、C組均成功建立AR動(dòng)物模型。

三組小鼠麻醉后觀察鼓膜象：對(duì)照組A組6只小鼠鼓膜結(jié)構(gòu)完整，半透明，標(biāo)志清，光錐明顯；實(shí)驗(yàn)組B組中5耳可見(jiàn)鼓膜變暗、內(nèi)陷及充血；實(shí)驗(yàn)組C組中8耳鼓膜為淡黃色或琥珀色，可見(jiàn)不同程度的血管紋，其中3耳可見(jiàn)中耳積液，鼓膜完整，說(shuō)明C組中3耳(25%，3/12)發(fā)生OME。

2.2三組血清總IgE表達(dá)量 實(shí)驗(yàn)組B組血清總IgE表達(dá)量為33.35±8.80 ng/ml，實(shí)驗(yàn)組C組為182.24±7.69 ng/ml，對(duì)照組A組檢測(cè)陰性，未達(dá)到檢測(cè)范圍(檢測(cè)范圍為70～200 ng/ml)。實(shí)驗(yàn)B組與C組均檢測(cè)到血清中IgE的表達(dá)增高，實(shí)驗(yàn)組C組較B組小鼠IgE表達(dá)明顯升高(P<0.05)。

2.3鼻腔黏膜HE染色 三組小鼠的鼻黏膜HE染色見(jiàn)圖2。對(duì)照組A組可見(jiàn)完整的結(jié)構(gòu)清晰的上皮細(xì)胞，基底膜連續(xù)且分界清晰，固有層可見(jiàn)少量血管、腺泡的分布(圖2a)；實(shí)驗(yàn)組B組鼻黏膜上皮細(xì)胞層數(shù)增加且排列不齊，固有層增厚可見(jiàn)腺泡分泌增加、少量嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2b)；實(shí)驗(yàn)組C組黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞層雜亂無(wú)章，基底膜界限不清，固有層成纖維細(xì)胞增多，大量嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，增厚明顯(圖2c)。

2.4三組中耳黏膜HE染色厚度測(cè)量 三組中耳黏膜厚度測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表2，可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組C組較對(duì)照組A組近咽鼓管黏膜增厚有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中段中耳鼓室黏膜增厚有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但鼓膜增厚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組中耳粘膜厚度觀察結(jié)果見(jiàn)圖3～6。

表2 三組小鼠三處中耳黏膜的厚度

2.5鼻黏膜及中耳骨髓腔中IL-5的表達(dá) 鼻黏膜中IL-5在固有層的腺泡細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)(圖7)，三組中表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)見(jiàn)表3；中耳骨髓腔內(nèi)IL-5在嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞的胞漿中表達(dá)陽(yáng)性(圖8，表3)，可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組C組鼻黏膜IL-5表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組A組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組B組與實(shí)驗(yàn)組C組、對(duì)照組A組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組C組中耳骨髓腔表達(dá)IL-5的陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組A組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，實(shí)驗(yàn)組B組與實(shí)驗(yàn)組C組、對(duì)照組A組之間IL-5表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。

表3 三組鼻黏膜與中耳骨髓腔表達(dá)IL-5的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)，

3 討論

近年來(lái)很多學(xué)者對(duì)分泌性中耳炎與變態(tài)反應(yīng)的相關(guān)性進(jìn)行了探索，變態(tài)反應(yīng)的侵入是通過(guò)鼻-咽鼓管-中耳途徑。關(guān)于變態(tài)反應(yīng)在OME發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用，推測(cè)有以下幾種可能[16]：①致敏原通過(guò)咽鼓管侵入，直接作用于中耳，使中耳產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)；②致敏原導(dǎo)致鼻或咽鼓管阻塞，過(guò)敏原雖無(wú)法進(jìn)入中耳，但中耳微環(huán)境發(fā)生改變(壓力、缺氧等狀態(tài))；③致敏原通過(guò)鼻-咽鼓管-中耳聯(lián)合體進(jìn)入中耳，發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，此后咽鼓管功能障礙，中耳微環(huán)境改變。本研究采用OVA全身基礎(chǔ)致敏和上呼吸道局部滴鼻的方式，2周后成功構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎小鼠模型，且在局部滴鼻第4周觀察到中耳積液的發(fā)生(3/12耳)，充分說(shuō)明Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)可以引發(fā)OME。

本研究通過(guò)HE染色后觀察三組鼻黏膜、咽鼓管以及中耳組織的變化，發(fā)現(xiàn)：①?gòu)淖罱K黏膜改變結(jié)果來(lái)看，隨著持續(xù)的過(guò)敏原刺激，該聯(lián)合體的黏膜改變較一致，即開(kāi)始的黏膜水腫-黏膜上皮細(xì)胞層增多排列紊亂、固有層炎性細(xì)胞的少量浸潤(rùn)、腺泡細(xì)胞增多-黏液上皮細(xì)胞的破壞、脫落以及固有層的成纖維細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，支持鼻-咽鼓管-中耳途徑可能是OME的致病途徑，且中耳是變態(tài)反應(yīng)的靶器官；②從黏膜改變時(shí)間節(jié)點(diǎn)來(lái)看，實(shí)驗(yàn)組B組可觀察到咽鼓管及近咽鼓管黏膜細(xì)胞水腫和炎性浸潤(rùn)，而中耳鼓室中段黏膜及鼓膜無(wú)明顯改變；實(shí)驗(yàn)組C組清晰可見(jiàn)咽鼓管黏膜明顯的結(jié)構(gòu)改變，而且中耳鼓室中段黏膜組織可見(jiàn)水腫。比較中耳近咽鼓管處黏膜、鼓室中段黏膜、鼓膜緊張部三處的中耳黏膜改變程度和先后順序，作為連接鼻咽部及中耳的唯一通道，近咽鼓管處黏膜的變化最為明顯，即咽鼓管內(nèi)口的改變最明顯，提示可能近咽鼓管段及咽鼓管段較先出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)，從而使中耳微環(huán)境改變(例如：缺氧、pH值及壓力改變)。

Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)由IgE介導(dǎo)，激活致敏細(xì)胞(肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)，產(chǎn)生IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，促進(jìn)Th2細(xì)胞的極性表達(dá)，Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL-4、IL-5表達(dá)增多產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)放大作用，從而使Th1/ Th2細(xì)胞比例失衡。而且IL-5是變態(tài)反應(yīng)遲發(fā)相中參與的重要細(xì)胞因子之一，刺激骨髓細(xì)胞的發(fā)生，趨化調(diào)集炎癥介質(zhì)和細(xì)胞，破壞黏膜[2]。本研究實(shí)驗(yàn)組C組中，鼻黏膜及中耳骨髓中IL-5表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞均明顯增多，與鼻黏膜及中耳黏膜的炎性破壞呈正比，說(shuō)明變態(tài)反應(yīng)參與分泌性中耳炎的發(fā)生，且激活中耳黏膜的黏膜免疫系統(tǒng)，持續(xù)破壞中耳局部微環(huán)境。

綜合上述觀察，從組織結(jié)構(gòu)改變來(lái)看，變態(tài)反應(yīng)致中耳的咽鼓管及近咽鼓管段黏膜組織改變明顯，說(shuō)明咽鼓管在中耳炎的發(fā)生中不可或缺；從功能來(lái)看，中耳骨髓中IL-5陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)增加，說(shuō)明中耳發(fā)生了變態(tài)反應(yīng)。結(jié)合這兩個(gè)方面得出變態(tài)反應(yīng)對(duì)中耳的影響可能最開(kāi)始致敏原通過(guò)咽鼓管逆行使近咽鼓管段及咽鼓管處黏膜激活，局部產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)；其后局部黏膜水腫甚至結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致咽鼓管功能障礙，中耳微環(huán)境改變，最終導(dǎo)致中耳炎的發(fā)生。

綜上所述，Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)通過(guò)鼻-咽鼓管-中耳途徑影響中耳，而且持續(xù)的變態(tài)反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致中耳局部組織處在高反應(yīng)狀態(tài)，變態(tài)反應(yīng)是分泌性中耳炎的危險(xiǎn)因素之一。本研究不足之處在于變應(yīng)性鼻炎模型動(dòng)物中耳積液的發(fā)生率低，未進(jìn)行聽(tīng)力學(xué)檢查及咽鼓管功能的檢測(cè)，后期將進(jìn)一步研究，并另外增加IL-5拮抗劑反相印證，從而讓實(shí)驗(yàn)內(nèi)容更加豐富，結(jié)論更加可靠。