陳放 王雪峰

因氨基糖苷類抗生素成本低和良好的治療革蘭氏陰性菌感染的療效而被廣泛使用[1]，然而，其耳毒性可導致內耳毛細胞損傷[2]。這類抗生素可導致內耳毛細胞發(fā)生氧化應激[3]和凋亡[4]，因此減輕氨基糖苷類抗生素的耳毒性具有重要的臨床意義[5]。谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)是一種對抗氧化應激的酶，有清除氧自由基、抗氧化[6]、抗凋亡[7]等作用。根據報道，GPX1在耳蝸中的含量相對較高，且在GPX1敲除的小鼠中，噪聲造成的毛細胞和神經纖維損傷會加重[8]，因此，推測其可能具有抗毛細胞凋亡的生物作用。目前未見GPX1對藥物性聾影響的報道；耳蝸毛細胞系(HEI-OC1)廣泛用于研究涉及耳毒性藥物作用和分子機制或篩選潛在的耳毒性藥物，鑒于此本研究觀察了GPX1在HEI-OC1細胞中的表達，并通過抑制GPX1的表達探討GPX1對新霉素誘導毛細胞凋亡的影響，為氨基糖苷類藥物性聾的防治提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1細胞株 耳蝸毛細胞系HEI-OC1由山東省耳鼻喉研究所提供。此細胞系美國House耳研究所(House Ear Institute, HEI)從永生化小鼠耳蝸Cotri器分離培養(yǎng)，并能在體外穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。

1.2主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、進口胎牛血清購自美國Gibco公司；Western blot試劑盒購自碧云天生物公司；GPX1抗體購自英國Abcam公司；Trizol試劑、TUNEL染色試劑盒、逆轉錄試劑盒和SYBR green Master Mix試劑盒購自美國賽默飛公司；Bax、BCL-2、Caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；Myosin-7a抗體購自美國Proteus Biosciences公司；β-Actin抗體購自中國中杉金橋公司；siRNA轉染試劑購自上海吉碼公司；新霉素、CCK8試劑盒、DAPI購自美國默克公司；酶標儀為上海必優(yōu)生物科技有限公司產品；PCR分析儀產于德國Eppendorf公司；激光掃描共聚焦顯微鏡源自徠卡公司。

1.3研究方法

1.3.1細胞培養(yǎng)及分組 將HEI-OC1細胞置于DMEM中，胎牛血清的體積為10%，并在二氧化碳體積分數為10%，溫度為33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。該細胞系的所有實驗均在對數生長期進行。首先將HEI-OC1細胞進行細胞培養(yǎng)后采用免疫熒光法觀察GPX1表達；然后給予0、1、3、5、10、15 mM新霉素處理24 h，采用CCK8法計算細胞活力和新霉素半抑制濃度；再將細胞分為兩組，對照組為不給予任何處理的細胞，新霉素組給予細胞10 mM新霉素處理24 h，采用免疫熒光染色、qRT-PCR和Western blot法觀察GPX1的表達；第四步將細胞分為空白對照組、陰性對照組、實驗組，空白對照組不進行任何處理，陰性對照組細胞轉染無意義的siRNA，實驗組細胞轉染siRNA-GPX1；轉染成功后，空白對照組不進行任何處理，陰性對照組細胞和實驗組分別給予10 mM新霉素處理24 h，采用CCK8法檢測三組細胞活力，免疫熒光染色、TUNEL染色和Western blot法檢測法三組細胞凋亡狀況。

1.3.2siRNA轉染HEI-OC1細胞 將HEI-OC1細胞以100 000個/mL的密度接種在6孔或96孔板中過夜，并按照siRNA-mate轉染試劑的說明進行轉染；最后，收集細胞用于蛋白質印跡、免疫熒光染色和qRT-PCR檢測。使用的所有siRNA序列如下：siRNA-Control 序列正義鏈：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’，siRNA-GPX1序列正義鏈：5’-CCAGGAGAAUGGCAAGAAUTT-3’，反義鏈： 5’-AUUCUUGCCAUUCUCCUGGTT-3’。

1.3.3細胞活力檢測及新霉素半抑制濃度測定 將HEI-OC1細胞(5 000個/孔)分三批接種到96孔板中，孵育過夜；第二天，給予新霉素，并在24小時后添加10 μL CCK-8試劑；孵育2小時后，使用酶標儀測量450 nm處的光密度(OD)，計算細胞活力值及半抑制濃度(50% inhibitory concentration, IC50)，比較細胞存活率，細胞存活率(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%，運用Graphpad Prism5.0軟件計算IC50值。

1.3.4蛋白質提取和Western blot檢測 通過Western blot檢測GPX1、抗凋亡因子BCL-2和促凋亡因子BAX的表達水平。使用RIPA裂解緩沖液提取HEI-OC1細胞的總蛋白，并根據說明使用BCA蛋白定量試劑盒測量蛋白質濃度，總共30 μg的蛋白質在95°C下變性10分鐘，然后通過十二烷基硫酸鈉鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離;將分離的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上，在含有5%脫脂奶粉的TBST中封閉1小時，并與一抗在4℃下孵育過夜;第二天用TBST洗滌后，將膜與二抗孵育1小時，并使用ECL試劑盒中的化學發(fā)光溶液在暗室曝光顯影。實驗結果顯示各樣品的灰度值，使用Image J軟件以β-Actin為對照蛋白來測量和分析GPX1、BCL-2和BAX的相對灰度值，分別表示各組蛋白的表達水平；蛋白相對灰度值=實驗蛋白灰度值/β-Actin蛋白灰度值。

1.3.5RNA提取和qRT-PCR檢測 按照說明檢測GPX1的mRNA表達，使用Trizol試劑從HEI-OC1細胞中提取總RNA，再用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。SYBR green Master Mix試劑盒和PCR分析儀用于通過qRT-PCR檢測各種基因表達。PCR條件如下：進行40個循環(huán)，在96℃下預變形2分鐘，在95℃下變性30秒，并在60℃下退火30秒。將每個樣品的基因表達水平標準化為相應的表達水平，并通過解鏈曲線確認每個PCR的特異性。GAPDH引物序列，正義鏈：5’-GTATGACTCCACTCACGG-3’，反義鏈5’- GGTCTGGCTCCTGGAAGA-3’。GPX1引物序列，正義鏈：5’- GTATGACTCCACTCACGG-3’，反義鏈5’-GGTCTGGCTCCTGGAAGA-3’。應用2-△△ct法對GPX1和GAPDH表達進行定量檢測，每組細胞至少重復3次。

1.3.6免疫熒光染色 HEI-OC1細胞用4%多聚甲醛固定1個小時，0.1%Triton X-100打孔10分鐘，然后用含1%牛血清白蛋白、5%滅活驢血清、0.02%疊氮化鈉和0.1%Triton X-100的PBS(PBT-1)封閉1小時;將樣品在含一抗的PBT-1中4℃孵育過夜。第二天將樣品在含有二抗、DAPI、1%牛血清白蛋白、0.1%Triton X-100和0.02%疊氮化鈉的PBS(PBT-2)中孵育1小時，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察樣品,根據TUNEL染色試劑盒說明檢測細胞凋亡,利用Image J軟件計算各組細胞陽性染色率；實驗組細胞陽性率=細胞陽性數/實驗組細胞總數。利用Image J軟件進行細胞計數以計算相對細胞活力，細胞活力=實驗組細胞數/對照組細胞數。

2 結果

2.1GPX1的表達及新霉素半抑制濃度 免疫熒光染色結果顯示，HEI-OC1細胞中表達Myosin-7a和GPX1(圖1a)。新霉素處理24小時后，新霉素的濃度越高細胞活力越低，HEI-OC1細胞中新霉素的半抑制濃度為10 mM(表1)。采用10 mM新霉素處理HEI-OC1細胞24小時后，新霉素組的GPX1熒光表達較對照組降低(圖1b)；且GPX1蛋白和mRNA表達水平均降低(圖1c、表2)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 不同濃度新霉素作用下HEI-OC1細胞的抑制率

表2 新霉素組和對照組GPX1表達水平比較

2.2siRNA轉染HEI-OC1細胞并活力檢測 免疫熒染色光結果顯示，siRNA成功轉染HEI-OC1細胞(圖2a)；實驗組中GPX1的mRNA和蛋白表達水平分別低于陰性對照組(圖2b、表3)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。CCK8結果顯示，未經新霉素處理的HEI-OC1細胞GPX1被敲低后，會稍稍降低細胞活力，但這種降低沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05，表4)。

表3 轉染后各組GPX1表達水平比較

表4 敲低HEI-OC1細胞中GPX1表達后各組細胞存活率和敲低HEI-OC1細胞中GPX1后新霉素給藥DAPI染色細胞計數

2.3抑制GPX1表達增加了新霉素損傷后HEI-OC1細胞的凋亡 轉染成功后給予10 mM新霉素處理細胞24 h，實驗組的細胞計數相較陰性對照組明顯降低(圖3、表4)；實驗組TUNEL染色陽性率高于陰性對照組(圖4a、表5)；實驗組中CleavedCaspase-3染色陽性率高于陰性對照組(圖4b、表5)；實驗組BAX的相對蛋白水平相對于陰性對照組增加，BCL-2的相對蛋白水平相對于陰性對照組降低(圖5、表6)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 各組細胞的凋亡情況

表6 給予新霉素后各組細胞BAX、BCL-2蛋白水平比較(相對灰度值，

3 討論

谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioe peroxidas, GSH-PX)是清除H2O2和脂質氫過氧化物的重要抗氧化酶，是抗氧化酶家族最重要的成員之一，其中GPX1被認為是其主要的酶，廣泛存在于所有組織中，被認為在機體的抗氧化防御中起著一定的作用。過氧化氫物會刺激細胞的增值，但過量的過氧化氫物會導致細胞凋亡。GPX1可以通過調節(jié)細胞過氧化物水平，有效減少了氧自由基的產生，從而保護細胞免受氧化應激造成的凋亡；其中的機制涉及抗凋亡基因Bcl-2的正調控和促進凋亡基因Bax的負調控。GPX1也是耳蝸內的主要同工型，其在螺旋器、螺旋神經節(jié)、血管紋和螺旋韌帶的細胞中高度表達[9]，因此，推測GPX1可能在耳蝸毛細胞的凋亡過程中起著作用。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡的類型，可以誘發(fā)聽覺細胞的凋亡因素有很多，主要因素有噪聲暴露、老年退行性病變和藥物毒性等。

有文獻報道，氨基糖苷類耳毒性的發(fā)生概率約為2%～5%，為藥物性耳聾的原因之首，其耳毒性主要表現為耳鳴、聽力下降和前庭功能障礙[2,10]。不同的藥物耳毒性作用部位也不同，慶大霉素主要作用于前庭毛細胞，可導致眩暈等臨床表現；而卡那霉素和新霉素等主要作用于耳蝸毛細胞，可導致嚴重的雙側感音神經性聾。在這些抗生素中，新霉素具有廣譜的抗菌活性，并且隨著細菌對其他抗生素和化學藥劑的細菌耐藥性增加，新霉素的使用正在增加。已有研究顯示，新霉素通過氧化應激誘導斑馬魚中耳蝸毛細胞凋亡。鑒于此，本研究觀察GPX1在新霉素引起HEI-OC1細胞凋亡中的作用。

HEI-OC1細胞可以被耳蝸毛細胞的特征標記表達，例如：Myosin-7a、math1、prestin和calbindin，這些標記經常用于耳毒性藥物的研究。本研究結果顯示在HEI-OC1細胞中，新霉素損傷后GPX1表達降低，表明GPX1可能在新霉素引起的耳聾中起了一定的作用。為了進一步觀察GPX1對新霉素損傷的耳聾的影響，本研究采用合成siRNA-GPX1并將其轉染到HEI-OC1細胞中，使GPX1的表達成功下調；然后觀察GPX1是否影響HEI-OC1細胞對新霉素誘導損傷的敏感性，通過免疫熒光染色結果觀察到，GPX1的敲低顯著降低了HEI-OC1細胞的活力，表明GPX1在新霉素損傷后維持HEI-OC1細胞的活力中具有重要作用。

GPX1具有保護肝臟細胞[11]和成纖維細胞[12]等細胞抗凋亡的生物學效應。在聽覺領域的研究中，也發(fā)現敲低小鼠的GPX1基因后，噪聲暴露導致耳蝸毛細胞和耳蝸神經纖維死亡增加。有研究表明，進行Cleaved Caspase-3和TUNEL染色可以檢測新霉素損傷后耳蝸毛細胞凋亡情況[13,14]；Caspase-3是細胞凋亡的效應因子，在一定程度上代表細胞的凋亡程度，可作為細胞凋亡標志物。在本研究中，敲低GPX1后給予HEI-OC1細胞新霉素損傷，發(fā)現細胞中TUNEL染色和Caspase-3的表達陽性細胞增加；BCL-2家族通常在抑制或促進細胞凋亡中起關鍵作用，內在的凋亡途徑由促凋亡因子BAX和抗凋亡因子BCL-2調控，后者誘導Caspase-3依賴性凋亡[15,16]。這項研究表明，給予新霉素損傷后，GPX1敲低的HEI-OC1細胞中BAX顯著增加，而BCL-2降低，進一步驗證了上述研究。

總之，本研究通過體外細胞實驗證明給予新霉素損傷后，GPX1敲低可增加HEI-OC1細胞凋亡；GPX1可能是預防氨基糖苷類抗生素引起的毛細胞死亡的治療新靶點。