王宇豪，馬小五，方玲玲，李林，李妙，張平洋

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）心血管超聲科，江蘇 南京 210006；*通信作者 張平洋 zhpy28@126.com

血管再狹窄（in-stent restenosis，ISR）是冠狀動脈介入手術(shù)常見的并發(fā)癥。隨著新一代支架和支架技術(shù)的發(fā)展，冠狀動脈發(fā)生狹窄的治愈率得到有效提高，致死率明顯降低，但仍容易發(fā)生ISR等并發(fā)癥，導(dǎo)致預(yù)后不理想。盡管最新的藥物球囊支架已將ISR的發(fā)生率降至20%以下，但仍處于較高水平[1-2]。目前發(fā)生ISR的具體機(jī)制尚未明確，除可能與支架直徑、長度、患者的基礎(chǔ)性疾病以及介入手術(shù)中的機(jī)械性損傷有關(guān)外[3]，在ISR的發(fā)生過程中，血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖和遷移是導(dǎo)致內(nèi)膜增生的主要機(jī)制[4]。

Pik3cb基因編碼磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的一種催化亞基p110β，人體內(nèi)普遍存在p110β表達(dá)，而PI3K/Akt通路與VSMC增殖密切相關(guān)[5]。納米微泡具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性，是靶向藥物運輸?shù)睦硐肫脚_，經(jīng)過修飾后可以負(fù)載治療性小分子藥物，實現(xiàn)靶向藥物的運輸[6-7]。超順磁性氧化鐵納米顆粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO）是合成的小分子γ-Fe2O3或Fe3O4顆粒，常用于MRI的增強(qiáng)造影劑[8]。此外，通過SPIO的磁特性，可以利用外部磁場的導(dǎo)向作用，使SPIO發(fā)生移動并富集，從而將與其相結(jié)合的藥物運輸?shù)襟w內(nèi)特定部位[9-10]。本研究擬使用SPIO制備的新型磁性納米微泡為載體，以Pik3cb基因為靶點，通過抑制p110β的表達(dá)，從而實現(xiàn)抑制VSMC異常增殖。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 主要試劑：Pik3cb質(zhì)粒和錯配質(zhì)粒（廣州銳博生物科技公司）；SPIO納米顆粒（南京東納生物科技公司）；磷酸化Akt抗體、β-actin抗體（Cell Signaling Technology）；ECL底物試劑盒（Biovision）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司）；三氯甲烷、Span80、聚乙烯醇等購自上海愛必信生物科技有限公司。主要儀器：小動物超聲成像儀Vevo2100（VisualSonics）；2F球囊導(dǎo)管（Edwards Lifesciences）；庫爾特顆粒分析儀（Beckman Coulter）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS）；數(shù)字水浴箱（Benchmark）。

1.2 納米微泡制備及檢測

1.2.1 SPIO-shPik3cb的制備 通過反相微乳法制備，步驟：室溫下稱取適量聚乳酸，加入10 ml三氯甲烷，待完全溶解后加入適量SPIO納米顆粒與超純水，于60°C水浴箱中混合均勻，加入適量山梨糖醇酐單油酸酯（Span80）和去氣超純水，在通入SF6氣體的條件下，利用超聲探頭持續(xù)處理5 min后，轉(zhuǎn)入羧基修飾的5%聚乙烯醇溶液（PEG）中，機(jī)械振蕩4 h，差速離心法收集得到表面羧基修飾的磁性納米微泡。利用靜電吸附原理負(fù)載質(zhì)粒shRNA，離心去除上清后，用1 ml PBS稀釋，得到攜Pik3cbshRNA的超順磁性氧化鐵納米微泡（SPIO-shPik3cb），用滅菌純水重懸，4℃條件下用玻璃試管保存。

1.2.2 磁性納米微泡和SPIO-shPik3cb的表征檢測 取適量上述樣品，用庫爾特顆粒分析儀檢測平均粒徑；在掃描電子顯微鏡下觀察其形貌。

1.2.3 SPIO-shPik3cb結(jié)合質(zhì)粒的能力檢測 取10 μl上述樣品，計算質(zhì)粒shRNA含量（約350 ng），另取1.5 μl裸質(zhì)粒，加PBS液稀釋至10 μl。在110 mV條件下，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 體外超聲成像效果和靶向性評價 為了研究SPIO-shPik3cb在外部超聲下的成像效果與在外部強(qiáng)磁場作用下的靶向性，分為生理鹽水對照組和SPIOshPik3cb組，將等量生理鹽水、SPIO-shPik3cb溶液分別加入1.5 ml EP管中，選用小動物超聲成像儀Vevo2100，超聲頻率設(shè)置為18 MHz，將探頭放置在試管表面，觀察探測區(qū)域內(nèi)有無白色氣泡點出現(xiàn)。將圓形永磁鐵放在試管底部附近5 min，觀察探測區(qū)域內(nèi)白色氣泡點的分布情況。

1.3 動物體外實驗

1.3.1 實驗動物建模 40只SPF級雄性SD大鼠，體重（200±20）g，由南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院實驗動物中心提供[動物許可證編號：SYXK（蘇）2016-0006]。研究人員均嚴(yán)格遵循動物實驗倫理規(guī)定。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，術(shù)前用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取頸部正中切口，鈍性分離皮下組織，避免損傷伴行神經(jīng)，暴露出右側(cè)頸總動脈，用動脈夾夾閉右側(cè)頸總動脈近心端和右側(cè)頸內(nèi)動脈起始處，沿右側(cè)頸外動脈將球囊導(dǎo)管逆行插入，擴(kuò)張球囊導(dǎo)管后緩慢拖拉以損傷內(nèi)膜，重復(fù)3次后退出球囊導(dǎo)管。肝素生理鹽水沖洗傷口，確認(rèn)血流恢復(fù)后，進(jìn)行逐層縫合。術(shù)后肌肉注射青霉素20萬IU預(yù)防感染。

1.3.2 分組及轉(zhuǎn)染實驗 將上述建模成功的大鼠喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)選擇并分為4組，每組6只。A組（SPIOshPik3cb組）經(jīng)尾靜脈注射0.2 ml SPIO-shPik3cb后行超聲輻照。B組（建模對照組）經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水后行超聲輻照。C組（SPIO-shcontrol組）經(jīng)尾靜脈注射等量空磁性納米微泡和錯配質(zhì)粒混合溶液后行超聲輻照。D組（Pik3cbshRNA組）經(jīng)尾靜脈注射等量Pik3cbshRNA后行超聲輻照。實驗過程中始終將圓形永磁鐵置于各組大鼠右側(cè)頸部皮膚下方。超聲輻照參數(shù)：超聲頻率1 MHz，峰值負(fù)壓強(qiáng)度0.6 W/cm2，占空比50%，照射時間為1 min，間隔30 s后重復(fù)3次。

1.4 新生血管觀察及相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

1.4.1 組織學(xué)和形態(tài)學(xué)分析 轉(zhuǎn)染實驗14 d后，過量麻醉處死各組大鼠，取出損傷處的頸總動脈血管，用4%多聚甲醛固定，制成連續(xù)石蠟切片。行HE染色，在光鏡下觀察新生內(nèi)膜增生情況，用Image-Pro Plus 6.0圖文分析軟件測量并計算內(nèi)膜面積與中膜面積（I/M）比值。

1.4.2 Western blot法分析 將各組損傷處頸總動脈段剪碎，加入20 μl蛋白裂解緩沖液中，裂解30 min后，移至EP離心管離心15 min后取上清液。通過BCA法測定各組樣品的蛋白濃度，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，灌膠、等量上樣后，將各電泳條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（PVDF膜）。室溫下封閉60 min，先后與一抗、二抗孵育，洗滌；采用DAB試劑顯色復(fù)染，最后將膠片掃描并拍照存檔。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 5.0軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPIO-Pik3cb的粒徑分布及形貌 磁性納米微泡的平均粒徑大小為（143.60±18.27）nm（圖1A），SPIOPik3cb的平均粒徑大小為（151.45±11.18）nm（圖1B）。負(fù)載質(zhì)粒shRNA前后的微泡粒徑未發(fā)生明顯變化。掃描電子顯微鏡顯示SPIO-Pik3cb為大小和分布較均勻的球形（圖1C）。

2.2 SPIO-shPik3cb結(jié)合質(zhì)粒的能力 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示：Marker泳道條帶清晰，DNA泳道為游離的質(zhì)粒shRNA，顯示有2個彌散的條帶；SPIOshPik3cb泳道集中在加樣孔附近。電泳結(jié)果顯示Pik3cbshRNA與磁性納米微泡成功結(jié)合（圖2）。

2.3 體外超聲成像效果和靶向性評價 在超聲作用下，生理鹽水組的探測區(qū)域內(nèi)為純黑色，無白色亮點出現(xiàn)（圖3A），與生理鹽水組相比，SPIO-Pik3cb組的探測區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)分布不均勻的白色亮點（圖3B）。當(dāng)加以外部強(qiáng)磁場5 min后，SPIO-Pik3cb組探測區(qū)域內(nèi)的白色亮點趨向于試管底部（圖3C）。

2.4 SPIO-shPik3cb可以抑制新生血管內(nèi)膜增生 轉(zhuǎn)染實驗14 d后，HE染色顯示各組大鼠血管內(nèi)膜均發(fā)生不同程度增生（圖4）。SPIO-shPik3cb組、建模對照組、SPIO-shcontrol組及Pik3cbshRNA組損傷血管I/M比值分別為0.48±0.08、0.96±0.12、0.89±0.05、0.66±0.07，與建模對照組相比，SPIO-shPik3cb組新生內(nèi)膜增生和面積均明顯減少（t=4.872，P＜0.05），見圖5。

2.5 SPIO-shPik3cb抑制ISR的作用機(jī)制 Western blot顯示SPIO-shPik3cb組和Pik3cbshRNA組的磷酸化Akt蛋白（p-Akt）表達(dá)量較建模對照組均有所下降，其中SPIO-shPik3cb能夠明顯下調(diào)p-Akt的表達(dá)，與SPIO-shPik3cb抑制損傷后血管內(nèi)膜增生的結(jié)果相符（圖6、7）。

3 討論

3.1 基因治療應(yīng)用于心血管疾病的現(xiàn)狀 VSMC異常增殖和遷移是導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生，繼而引發(fā)ISR等一系列并發(fā)癥的主要機(jī)制。ISR發(fā)生后，支架介入治療的遠(yuǎn)期預(yù)后較為不理想。因此，急需尋找另一種可行的抗新生內(nèi)膜增生的治療方案。近年來，基因治療作為一項新興的技術(shù)，已用于研究心血管疾病及其相關(guān)臨床并發(fā)癥的防治中。RNA干擾是指由特定RNA誘發(fā)，可以在轉(zhuǎn)錄后水平降解靶基因的同源mRNA，進(jìn)而沉默組織或細(xì)胞水平上目標(biāo)基因的表達(dá)[11]。外源性治療用核苷酸藥物在到達(dá)靶細(xì)胞后，主要通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但往往需要到達(dá)細(xì)胞核才能發(fā)揮作用。在這個過程中，外源性治療用核苷酸藥物容易被血清中的核酸酶降解，導(dǎo)致其不能持續(xù)穩(wěn)定地發(fā)揮作用，限制了其進(jìn)一步臨床應(yīng)用。探索新型載體對實現(xiàn)靶向基因治療有重要意義。

3.2 磁性納米材料用作基因治療載體的特點 以往臨床試驗中常用的載體通常是病毒載體和裸質(zhì)粒[12]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，新一代磁性納米材料在光熱療法、光動力療法和磁熱療法等領(lǐng)域中均得到廣泛應(yīng)用[13-15]。PEG具有高親水性和高生物相容性，是一種高效的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑[16]。本研究制備的SPIO納米微泡載質(zhì)粒前后的平均粒徑變化不大，依然維持在納米范圍內(nèi)。瓊脂糖凝膠電泳實驗證實磁性納米微泡與質(zhì)?？梢跃o密結(jié)合，在血液循環(huán)中具有較好的穩(wěn)定性。體外超聲成像實驗中，SPIO-shPik3cb在磁場的作用下具有較好的靶向性，可以發(fā)生移動和團(tuán)聚，提高靶區(qū)域內(nèi)的藥物濃度。在頸動脈球囊損傷大鼠模型中，通過尾靜脈注射給藥后，SPIO-shPik3cb可以在磁場的作用下到達(dá)損傷的血管壁附近，轉(zhuǎn)染VSMC。與傳統(tǒng)的微泡相比，基于超順磁性材料的納米微泡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、具有靶向性，在轉(zhuǎn)染效率上更有優(yōu)勢，避免了大劑量用藥的潛在副作用。

3.3 靶向超聲介導(dǎo)SPIO-shPik3cb能夠提高轉(zhuǎn)染效率 PI3K IA型是被研究最多的PI3K家族里的同工酶，是由p85調(diào)節(jié)亞單位和p110催化亞單位組成的異源二聚體，磷脂酰肌醇二磷酸被轉(zhuǎn)化為三磷酸肌醇。三磷酸肌醇是一種重要的第二信使，可以與蛋白激酶B即Akt結(jié)合，促使Akt從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，激活A(yù)kt蛋白上的絲氨酸磷酸化位點（Ser473）并使其磷酸化，繼而調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖、凋亡、自噬相關(guān)的蛋白[17]。本研究通過對編碼p110 β亞單位的Pik3cb基因進(jìn)行RNA干擾，下調(diào)PIK3/Akt通路的活性，最終抑制大鼠損傷血管的VSMC增殖。超聲的空化效應(yīng)是一種物理現(xiàn)象，液體中的空化核在聲波的作用下產(chǎn)生振蕩，當(dāng)聲壓超過一定值時氣泡發(fā)生破裂，泡內(nèi)聚集的能量隨即釋放出來，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面形成微小的聲孔[18-19]。通過HE染色和Western blot發(fā)現(xiàn)，與裸質(zhì)粒相比，SPIO-shPik3cb組抑制新生內(nèi)膜增生的效果更明顯，p-Akt的表達(dá)量也明顯下降，在轉(zhuǎn)染大鼠損傷血管壁后能有效抑制VSMC增殖的效應(yīng)?？赡苁怯捎诎邢虺暤淖饔茫琒PIO-shPik3cb可以穿過微小的聲孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，釋放出攜帶的基因藥物，實現(xiàn)對病變部位的靶向藥物傳遞。

總之，本研究成功制備了SPIO-shPik3cb，在磁場引導(dǎo)作用下，可以靶向運輸該磁性納米微泡至大鼠損傷血管壁處，通過靶向超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，繼而抑制VSMC增殖，以減輕新生內(nèi)膜增生，這主要是通過下調(diào)Pik3cb蛋白表達(dá)實現(xiàn)的，為臨床上血管增生型疾病如動脈粥樣硬化和冠狀動脈介入術(shù)后的ISR治療提供了新的思路。本研究仍存在一定的不足之處，如未能明確其對血管外組織或器官是否有潛在的副作用，最新研究提示納米復(fù)合物在體內(nèi)的代謝場所主要位于腎臟和肝臟[20]，還需進(jìn)一步研究驗證。