裴徐梨，荊贊革,*，焦 鵬，唐 征

(1 昆明學院 農學與生命科學學院，昆明 650214；2 溫州科技職業(yè)學院 農業(yè)與生物技術學院，浙江溫州 325006)

青花菜(BrassicaoleraceaL.var.italica)為十字花科蕓苔屬甘藍種的一個變種，在世界各地廣泛栽培。細胞質雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)的應用可以有效提高青花菜雜交種質量[1]。目前青花菜細胞質雄性不育發(fā)生機制仍未徹底明確。因此，進一步研究青花菜長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，LncRNAs)在雄性不育發(fā)生過程中的作用顯得尤為重要。

研究結果表明LncRNAs可在轉錄、轉錄后和表觀遺傳水平上調控多種生物學過程[2-3]。 自LncRNA在人類中報道以來[4]，動植物中鑒定得到越來越多LncRNA。然而，對植物LncRNA的深入研究僅限于少數(shù)模式植物。如水稻XLOC_057324可以影響穗軸發(fā)育和植株育性[5]。玉米的zm401可調控小孢子的發(fā)育[6]。擬南芥的IPS1可通過抑制miR399的剪切來促進磷的吸收[7]。

目前，一些與細胞質雄性不育相關的基因被克隆出來并進行深入研究。然而，關于LncRNA在雄性不育過程的作用卻知之甚少。本研究利用illumina測序技術鑒定了青花菜細胞質雄性不育相關LncRNAs，并對其靶基因和表達特征進行了研究。并利用qRT-PCR技術對部分差異LncRNAs的表達特征進行了檢測。為進一步闡明LncRNAs參與青花菜雄性不育發(fā)生機制提供新的路徑。

1 材料和方法

1.1 材 料

以飽和回交的青花菜Ogu細胞質雄性不育系及其保持系為試驗材料，采集不同發(fā)育時期的花蕾以及花蕾的不同部位[8]。

1.2 方 法

1.2.1 青花菜RNA文庫構建和RNA-seq數(shù)據分析總RNA提取合格后，進行文庫構建，最后使用illumina HiSeq2500進行測序。利用TopHat軟件將過濾得到的干凈讀序比對到參考基因組。使用Cufflinks和Scripture軟件拼接轉錄本。

1.2.2 青花菜LncRNA鑒定對拼接好的轉錄本進行LncRNA鑒定。首先去除長度< 200 nt、reads覆蓋度小于3及與已知mRNA重疊的3種轉錄本。然后分別利用CPC和CNCI軟件預測轉錄本的蛋白編碼潛能，去除CPC評分大于0且CNCI評分小于0的轉錄本。剩余含有已知蛋白結構域的轉錄本在Pfam數(shù)據庫中進一步篩除。最后使用Cuffcompare將組裝好的轉錄本與數(shù)據庫中的rRNAs、tRNAs、snRNAs、snoRNAs、premiRNAs和pseudogenes(假基因)進行比對，剩余的轉錄本則被定義為候選LncRNAs。

1.2.3 青花菜差異表達LncRNA的篩選利用FPKM法計算LncRNA轉錄本的表達量。以|fold change|≥2且FDR <0.05為標準來鑒定差異表達LncRNAs。

1.2.4 青花菜LncRNAcis靶基因預測與功能注釋LncRNAs可通過順式(cis)作用方式調控鄰近基因，其上下游各100 kb內的編碼基因可作為cis靶基因，并對其進行功能注釋。P≤0.05的GO和KEGG條目則定義為顯著富集。

1.2.5 雄性不育相關LncRNAs的qRT-PCR分析qRT-PCR采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(大連TaKaRa公司)進行。反應條件參照裴徐梨前期研究，以青花菜actin基因作為內參基因[9]。隨機選擇16個雄性不育相關的LncRNAs進行qRT-PCR檢測，引物序列見表1?；蛳鄬Ρ磉_量通過2-ΔΔCt法進行計算。

2 結果與分析

2.1 RNA測序結果分析

不育系和保持系分別獲得約10.8 G和9.8 G的干凈讀序，GC含量分別為45.64%和45.19%。將干凈讀序比對到參考基因組，不育系及其保持系分別有54.95% 和55.74% 的序列可比對上(表2)。

2.2 青花菜LncRNAs鑒定

轉錄本拼接共得到174 813條轉錄本。根據鑒定流程，排除掉長度< 200 bp、外顯子數(shù)<2和最小讀序覆蓋<3的4 479條轉錄本、31 714條已知蛋白編碼轉錄本和126 759條不在i、u和x組的轉錄本。最終4 326條轉錄本被鑒定為高置信度的LncRNA。其中，基因間隔區(qū)LncRNA為4 033條，內含子間LncRNA 為181條，反義LncRNA為112條。

2.3 青花菜不育系及其保持系差異表達LncRNAs的鑒定

對差異表達LncRNA (differentially expressed LncRNA，DE-LncRNA)進行鑒定，在不育系和保持系中共得到37個LncRNA存在差異。其中34個DE-LncRNA同時存在于2個樣本中，3個DE-LncRNA(XLOC_005260、XLOC_007656和XLOC_034364)為保持系特有的。

對LncRNA的差異表達程度進行分析，發(fā)現(xiàn)在上調LncRNA中XLOC_005260的log2FC值(4.75)最高，XL0C_041886(log2FC = -4.50)是下調LncRNA中表達差異最顯著的。聚類結果表明這些差異LncRNA在不育系和保持系中展現(xiàn)出不同的表達模式(圖1)。

2.4 青花菜不育系及其保持系差異LncRNAs的靶基因預測

對差異LncRNA的cis靶基因進行預測，共得到370個靶基因。每個差異LncRNA靶向的靶基因數(shù)目差異較大。其中XLOC_006651的靶基因數(shù)最多，為25個，其次是XLOC_038298(24個)和XLOC_017574(19個)。同時，2個差異LncRNA只有1個靶基因。

GO分析表明，這些靶基因可注釋到19個生物學過程條目、16個細胞成分條目和17個分子功能條目。GO條目富集分析發(fā)現(xiàn)預測靶基因參與了多種生物過程，包括細胞內、蛋白結合和細胞蛋白代謝過程。KEGG分析得到34條與差異LncRNAs相關的代謝通路，其中靶基因參與最多的通路為氨基酸生物合成、碳代謝和核糖體相關。

2.5 青花菜差異LncRNAs的表達特征分析

為了驗證差異LncRNA的表達模式，隨機選取16個差異LncRNA進行qRT-PCR分析(圖2)。結果發(fā)現(xiàn)：XLOC_011575、XLOC_039677、XLOC_037356、XLOC_013157、XLOC_006651、XLOC_013121、XLOC_016660、XLOC_003494在不育系花蕾發(fā)育早期表達量較高，之后隨著花蕾的發(fā)育，表達量逐漸下降；而XLOC_040653、XLOC_021769、XLOC_038964、XLOC_037468、XLOC_017574和XLOC_014153隨著不育系花蕾發(fā)育呈現(xiàn)出先下降后上升的模式。在保持系花蕾發(fā)育不同階段，XLOC_013157、XLOC_034182、XLOC_037468、XLOC_017574、XLOC_014153、XLOC_006651、XLOC_013121、XLOC_016660、XLOC_003494表達量逐漸下降；XLOC_040653、XLOC_011575、XLOC_039677和XLOC_037356呈現(xiàn)出先升后降的表達模式，而XLOC_012613、XLOC_021769、XLOC_038964則是先降后升。XLOC_038964和XLOC_012613在花蕾不同發(fā)育階段不育系的表達量均高于保持系。

青花菜花蕾不同部位表達特性分析結果表明16個差異LncRNA在花梗、花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊中均可表達。其中，XLOC_038964、XLOC_011575、XLOC_013157在花蕾雄蕊中表達量最低，花梗、花萼和花瓣中逐漸升高，雌蕊表達量最高。XLOC_039677、XLOC_037356、XLOC_034182和XLOC_017574呈現(xiàn)出相似的表達模式，只是其在花瓣的表達量有所下降。所有檢測的LncRNA中XLOC_037468在雌蕊中表達量最高。

3 討 論

大量研究表明，植物LncRNA可參與多種復雜的生物學過程，如開花調控、果實發(fā)育以及逆境脅迫響應[10]。然而，青花菜LncRNAs的生物學功能尚不清楚。本研究系統(tǒng)鑒定和分析了青花菜雄性不育相關LncRNAs，共獲得4 326個LncRNA，其中37個差異表達，研究結果將有助于深入探討青花菜LncRNAs參與的CMS發(fā)生機制。

LncRNAs靶基因預測可有效探究LncRNA潛在功能[11]。糖代謝對青花菜雄性不育有重要意義。在小麥胼胝質合成和降解過程中，與糖苷酶代謝相關基因的活性在可育系和不育系之間存在差異[12]。在本研究中，6個差異LncRNA為與糖苷酶代謝相關的靶基因。表達分析結果表明，它們大部分在雄性不育發(fā)生過程中表達上調。這些結果表明LncRNAs可能通過糖代謝來調控青花菜的育性。此外，還發(fā)現(xiàn)6個差異LncRNAs參與了谷胱甘肽代謝。谷胱甘肽S-轉移酶(GST)是谷胱甘肽解毒系統(tǒng)必不可少的調節(jié)因子。過量的活性氧可觸發(fā)植物細胞程序性死亡，最終導致絨氈層細胞退化和雄性不育[13]。花粉敗育過程中產生的過量活性氧可改變GST基因的表達。本研究結果發(fā)現(xiàn)大部分靶向GST基因的LncRNA在FS花蕾中上調表達，進一步表明這幾個LncRNA可能是通過谷胱甘肽代謝來參與青花菜CMS的過程。

LncRNAs是基因轉錄的調節(jié)因子[9]。本研究結果中多個差異LncRNA的靶基因為轉錄因子。NAC轉錄因子是XLOG_011575的靶基因，可在水稻中顯著調控可育花粉比例和雄性不育[14]。本研究測序數(shù)據得出XLOG_011575在不育花蕾中表達上調，表明NAC可能在青花菜CMS發(fā)生過程中起重要作用。MYB是另外一個重要的轉錄因子。已有研究表明，MYB26在花藥內壁二次增厚過程中對花藥開裂和育性起關鍵作用[15]。而MYB33和MYB65是擬南芥花藥正常發(fā)育的重要組成部分[16]。本試驗鑒定到的靶基因中發(fā)現(xiàn)了3個MYB家族轉錄因子， 推測LncRNA通過調控MYB表達量的變化可能會導致青花菜的CMS發(fā)生。