李春鑫，王會(huì)偉，王 艷，劉玉蘭，陳道玉，楊鐵鋼*

(1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，鄭州 450002； 2 河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001；3 息縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，河南信陽(yáng) 464300)

世界人口的不斷增長(zhǎng)和社會(huì)生活水平的提高，使人類(lèi)社會(huì)對(duì)食用植物油的消費(fèi)需求日益增長(zhǎng)，同時(shí)，世界范圍內(nèi)對(duì)低價(jià)生物柴油的需求也十分旺盛，這都要求油料作物必須保持產(chǎn)量水平的持續(xù)提高[1]。因此，亟需尋找一種可以快速提高油料產(chǎn)能的新途徑。油莎豆(CyperusesculentusL. var.satovus)，通用名‘虎堅(jiān)果’(tigernut)，又名‘虎堅(jiān)果莎草’(tigernut sedge)、‘鐵荸莽’、‘地下核桃’等，是目前已知植物中唯一在地下塊莖中大量積累油份的作物[1]。其產(chǎn)量高、易種易管、抗旱耐澇、邊際土壤適應(yīng)性強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[1]，既可食用也可用作生物燃料，是較為理想的作物類(lèi)型[2]。油莎豆在植物學(xué)上屬于單子葉綱莎草科莎草屬多年生草本植物[1]，廣泛分布于熱帶、溫帶和寒帶，屬于C4型植物[3]，在農(nóng)業(yè)上被用作一年生作物，在中國(guó)黃淮地區(qū)生育期約130～150 d。

油莎豆通過(guò)地下匍匐莖(后面統(tǒng)稱(chēng)為莖豆)膨大收獲經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量，其莖豆含20%～40%淀粉、20%～36%油、15%～20%糖、5%～9%蛋白質(zhì)和6%～10%纖維[1, 4]，在非洲部分國(guó)家一直被作為重要營(yíng)養(yǎng)食物來(lái)源之一[1]。研究顯示油莎豆莖豆中含有高水平的磷、鐵和鉀，以及維生素E和C[5]。油莎豆莖豆有生吃、榨油、面粉全食和制作成豆奶等多種食用方式，其中，以油莎豆為主原料的飲料在西班牙和西歐廣受歡迎[6]。油莎豆莖豆中含有大量的糖分，可用作冰淇淋、餅干、沙拉、湯、酸奶、糖果、嬰兒食品、保健棒、面包、蛋糕和其他食品的調(diào)味劑[7]。有研究表明，油莎豆莖豆具有疏肝、通氣、健脾和健胃功效，在促進(jìn)血液循環(huán)，減少心血管疾病和心臟病發(fā)作，防止中風(fēng)和呼吸道炎癥，治療腸胃脹氣和降低患結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)等方面也有較高的藥用潛力[1,6]。

莎草科物種普遍存在后減數(shù)分裂行為及染色體的分裂和融合[8]。油莎豆染色體數(shù)目的研究結(jié)果也存在爭(zhēng)議。有報(bào)道認(rèn)為它的基本染色體數(shù)目(n)是54或108[8]，但有學(xué)者先后得出油莎豆種內(nèi)染色體數(shù)目為18、108和206等不同結(jié)論[8-9]。中國(guó)的油莎豆經(jīng)過(guò)多次國(guó)外引種和國(guó)內(nèi)各省份間交換，目前保存的種質(zhì)來(lái)源復(fù)雜，背景不明，其染色體數(shù)目和倍性研究基本處于空白狀態(tài)，嚴(yán)重阻礙了油莎豆品種的遺傳改良和基礎(chǔ)研究工作的深入開(kāi)展。

莖豆是油莎豆核心經(jīng)濟(jì)價(jià)值部位，從莖豆形態(tài)上，可以分為中長(zhǎng)、中圓及大粒型3類(lèi)。本研究選用‘豫油莎2號(hào)’(中圓粒)、‘豫油莎3號(hào)’(中長(zhǎng)粒)和‘YYS-4’(大粒)3種粒型油莎豆材料，通過(guò)分析株高、分蘗、粒重、單株結(jié)豆數(shù)、光合特性等形態(tài)性狀和品質(zhì)性狀，明確了中國(guó)油莎豆種質(zhì)的形態(tài)學(xué)和品質(zhì)性狀特點(diǎn)。利用染色體制片、熒光染色和端粒探針熒光原位雜交技術(shù)，首次對(duì)中國(guó)3種粒型油莎豆材料的染色體數(shù)目進(jìn)行了解析，其結(jié)果對(duì)于促進(jìn)中國(guó)油莎豆細(xì)胞學(xué)的發(fā)展，加快中國(guó)油莎豆資源的應(yīng)用和基礎(chǔ)研究具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 供試材料

3種不同粒型油莎豆材料‘豫油莎3號(hào)’(圖1，A)、‘豫油莎2號(hào)’(圖1，B)、‘YYS-4’(圖1，C)均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所油莎豆育種研究室選育和提供。供試材料各選取5粒莖豆，以單粒播的方式種植于沙壤土中，在植株長(zhǎng)至成熟后，測(cè)定每個(gè)材料的形態(tài)學(xué)相關(guān)性狀，測(cè)定性狀有：株高(自地面量至最高葉片頂端)、分蘗數(shù)(分蘗高度大于25 cm)、葉長(zhǎng)(主分蘗最長(zhǎng)葉片自葉環(huán)至葉尖1/3處寬度)、葉寬(主分蘗最長(zhǎng)葉片自葉環(huán)至葉尖1/3處寬度)、單粒重(單株莖豆總重/單株總粒數(shù))、粒色、粒長(zhǎng)(挑選10粒飽滿(mǎn)的莖豆，總長(zhǎng)度/10)、粒寬(挑選10粒飽滿(mǎn)的莖豆，總寬度/10)及結(jié)實(shí)集中度(重量大于等于平均單粒豆重的粒數(shù)/總粒數(shù))。性狀測(cè)定結(jié)果去掉最高和最低值，剩余3個(gè)值取平均數(shù)作為該性狀測(cè)定值。

1.2 供試材料品質(zhì)性狀測(cè)定

取3個(gè)供試材料的莖豆200 g左右，送至農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試鄭州分中心進(jìn)行品質(zhì)性狀測(cè)定，蛋白質(zhì)、總灰分、含油量、淀粉、可溶性糖測(cè)定分別依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB5009.5-2016、GB5009.4-2016、NY/T1285-2007、GB5009.9-2016和GB/T37493-2019進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 光合性狀測(cè)定

在晴天條件下選取3個(gè)供試材料，每個(gè)材料選取5株長(zhǎng)勢(shì)、葉片著生部位、葉面積大小和朝向基本一致的主莖葉片，測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合參數(shù)，剔除最高和最低值，剩余3株數(shù)據(jù)取平均值作為測(cè)定結(jié)果。測(cè)定時(shí)盡量測(cè)定葉片中部并避開(kāi)葉片的主脈。葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定使用FMS-2脈沖調(diào)制式熒光儀(Hansatech, UK)，光合作用測(cè)定使用CIRAS-3便攜式光合熒光測(cè)定儀(美國(guó)PP Systems公司)，以上兩種設(shè)備測(cè)定時(shí)嚴(yán)格按照儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 染色體數(shù)目分析

1.4.1 材料處理選用來(lái)自同一單株的成熟、飽滿(mǎn)莖豆，統(tǒng)一浸種72 h，每6 h換水一次，待莖豆萌動(dòng)露白后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，進(jìn)行生根培養(yǎng)(底部鋪設(shè)雙層濾紙)，待莖豆芽點(diǎn)基部生出白色的吸水根時(shí)，即可進(jìn)行取樣制片。所有材料試驗(yàn)均在20～22 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行，所有材料均設(shè)置生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.4.2 染色體制片和計(jì)數(shù)主要參考Han等[10]的方法，并根據(jù)油莎豆的莖豆生長(zhǎng)特點(diǎn)進(jìn)一步優(yōu)化后制定，具體的方法為：(1)待樣品根尖長(zhǎng)度達(dá)到2～3 cm時(shí)進(jìn)行剪根。剪根前，事先準(zhǔn)備0.5 mL頂端扎孔的離心管，并在實(shí)驗(yàn)前將管內(nèi)用水潤(rùn)濕。將剪下的根尖放入管中插入冰內(nèi)；(2)將裝有根尖的離心管放置于充氣罐內(nèi)，充入0.9～1.0 MPa的N2O，靜置處理2 h；(3)在冰浴條件下，將90%預(yù)冷冰乙酸加入離心管內(nèi)，靜置處理10 min，用膠頭滴管將冰乙酸吸出，并用ddH2O進(jìn)行2次清洗；(4)用刀片將根尖白色部分切下，放入裝有25 μL酶液的0.5 mL離心管中。酶液為纖維素酶與果膠酶3∶1混合，酶解在37 ℃水浴條件下進(jìn)行1 h(具體時(shí)間可根據(jù)根尖大小調(diào)整)；(5)用70%的酒精將根尖清洗3次，并用解剖針將根尖在剩余酒精中充分破碎和震蕩，4 000 r/min離心，將細(xì)胞離心至管底后，通過(guò)倒置和晾干將剩余酒精從離心管中移除；(6)根據(jù)根尖數(shù)量，在離心管內(nèi)加入25～45 μL冰乙酸，瞬時(shí)離心后，充分震蕩混勻。將潔凈的載玻片放置在預(yù)先準(zhǔn)備的濕潤(rùn)的盒子中，室溫保持在23 ℃左右。從離心管中吸取8 μL細(xì)胞懸浮液，在距離載玻片一定距離的正上方滴下，隨后立即將盒子蓋上，直到細(xì)胞散開(kāi)，載玻片晾干后取出；(7)將染色體標(biāo)本在普通光學(xué)顯微鏡或相差顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，找到目標(biāo)分裂相保存?zhèn)溆?，在避光狀態(tài)下，滴加熒光染料DAPI，加上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片四周封固，備用；(8)用熒光顯微鏡觀察染色體數(shù)目和核型。確定每個(gè)染色體數(shù)目時(shí)，所觀察的分裂相數(shù)目不低于20個(gè)。

1.5 端粒熒光雜交試驗(yàn)

根據(jù)Tang等[11]方法，利用端粒特異性探針Telo對(duì)油莎豆材料有絲分裂中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交試驗(yàn)。端粒特異性探針Telo(TTTAGG-GTTTAGGGTTTAGGG)由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用6-carboxyfluorescein (6-FAM)對(duì)探針序列進(jìn)行綠色熒光標(biāo)定，其合成按照Lang等[12]報(bào)道的方法。 由于細(xì)胞會(huì)在試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)破碎和解體情況，DAPI雜交和端粒雜交試驗(yàn)可能會(huì)用樣本不同的細(xì)胞開(kāi)展。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性分析采用軟件SPSS(20.0)的最小顯著性法(LSD)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種油莎豆主要農(nóng)藝性狀比較

3個(gè)材料粒色均為深棕色，其他形態(tài)學(xué)性狀測(cè)定的表型見(jiàn)表1。產(chǎn)量直接相關(guān)的分蘗數(shù)、單粒重和單株結(jié)豆數(shù)3個(gè)性狀在材料間的差異顯著。其中，‘豫油莎3號(hào)’分蘗數(shù)最高，分別是‘豫油莎2號(hào)’的2.1倍、‘YYS-4’的1.5倍；‘YYS-4’的單粒重則最高，是其他兩個(gè)材料的2倍以上；單株結(jié)豆數(shù)‘豫油莎3號(hào)’達(dá)245個(gè)，分別是‘豫油莎2號(hào)’、‘YYS-4’的1.3倍和1.6倍；粒長(zhǎng)和粒寬屬于單粒重的亞性狀，在3個(gè)材料間的表現(xiàn)與粒重基本一致，并均以‘YYS-4’最高，‘豫油莎2號(hào)’粒寬高于‘豫油莎3號(hào)’，但粒長(zhǎng)值則相反。其他性狀均以‘豫油莎2號(hào)’的檢測(cè)值為3個(gè)材料中最高。

2.2 3種油莎豆主要品質(zhì)相關(guān)性狀比較

3個(gè)油莎豆的品質(zhì)性狀見(jiàn)表2。其中，蛋白質(zhì)含量以‘YYS-4’最高(7.63%)，‘豫油莎2號(hào)’最低(4.70%)；油分含量以‘豫油莎2號(hào)’最高，達(dá)32.00%，‘豫油莎3號(hào)’和‘YYS-4’基本相同；淀粉含量在3份供試材料中都在30%以上，其中‘YYS-4’最高，達(dá)36.7%；可溶糖含量以‘豫油莎3號(hào)’最高(21.30%)，‘YYS-4’也表現(xiàn)出較高的糖分含量(19.28%)；總灰分含量以‘豫油莎2號(hào)’最高(4.40%)，‘YYS-4’最低(1.80%)。

2.3 3種油莎豆主要光合特性比較

葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定結(jié)果顯示(表3)，‘豫油莎2號(hào)’的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)最高(0.800)，顯著高于‘豫油莎3號(hào)’和‘YYS-4’(分別為0.783和0.778)；實(shí)際光量子效率(PS Ⅱ)以‘豫油莎2號(hào)’最高，為0.739；熱耗散能力即非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)以‘豫油莎2號(hào)’最小(1.129)，‘YYS-4’最高(1.416)；電子傳遞效率(ETR)在 3個(gè)材料差異較小。

3個(gè)油莎豆材料光合性能表現(xiàn)為：胞間 CO2濃度(Ci)以‘豫油莎2號(hào)’最低(293.00 μmol·mol-1)，‘YYS-4’材料最高(336.25 μmol·mol-1)；3個(gè)材料的氣孔導(dǎo)度(Gs)變幅為261.67～338.50 mmol·mol-1，并以‘YYS-4’最大、‘豫油莎2號(hào)’最??；葉片凈光合速率(Pn)以‘豫油莎2號(hào)’最高(18.17 μmol·m-2·s-1)，‘YYS-4’材料最低(15.13 μmol·m-2·s-1)；蒸騰速率(Tr)和水分利用率(WUE)是相互關(guān)聯(lián)的2個(gè)參數(shù)，‘豫油莎2號(hào)’和‘豫油莎3號(hào)’的蒸騰速率較低，相對(duì)應(yīng)的水分利用率均顯著高于‘YYS-4’。

2.4 3種油莎豆染色體數(shù)目比較

3份供試材料根尖有絲分裂中期細(xì)胞染色體壓片和DAPI熒光染色的結(jié)果顯示，3個(gè)材料的染色體數(shù)目均為156條，長(zhǎng)度為0.5～1.2 μm(圖2)，3種材料的生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果也均無(wú)差別。

表1 3種粒型油莎豆材料的主要農(nóng)藝性狀

表2 3種粒型油莎豆材料的品質(zhì)性狀

表3 3種粒型油莎豆材料的光合性狀

為了進(jìn)一步確認(rèn)DAPI染色結(jié)果，對(duì)3份供試材料根尖的有絲分裂中期細(xì)胞染色體進(jìn)行端粒序列熒光原位雜交。結(jié)果顯示，‘豫油莎3號(hào)’、‘豫油莎2號(hào)’和‘YYS-4’的染色體數(shù)目均為156條(圖3)，與DAPI染色后計(jì)數(shù)的結(jié)果相同。生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果也完全一致。由此，確認(rèn)3份供試材料染色體數(shù)目相同，且均為156條。

3 討 論

油莎豆起源于非洲[1]，20世紀(jì)50年代中國(guó)將其作為油料作物引入國(guó)內(nèi)。有正式記載的引種分別是1952年的前蘇聯(lián)、1960年的保加利亞和20世紀(jì)70年代的朝鮮大粒類(lèi)型[2]，中國(guó)的油莎豆種質(zhì)經(jīng)過(guò)數(shù)十年的種質(zhì)交流和自留種，各省、地區(qū)油莎豆材料的來(lái)源和譜系資料混亂。目前，油莎豆尚未發(fā)現(xiàn)可用的雜交種，相比可雜交的其他植物，油莎豆育種更加依賴(lài)現(xiàn)有種質(zhì)資源的初始綜合農(nóng)藝性狀。從地上部形態(tài)看，油莎豆葉型基本分為寬葉、細(xì)葉兩種類(lèi)型；粒色共有黃、棕、黑、紅共4種顏色[13]，中國(guó)現(xiàn)有資源以棕色和黃色占絕大多數(shù)，少數(shù)資源呈現(xiàn)黑色和紅色。而與產(chǎn)量直接相關(guān)的粒型性狀可分為中長(zhǎng)粒、中圓粒、大粒3種類(lèi)型，本研究對(duì)3種粒型油莎豆的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)分析可為今后的育種和應(yīng)用提供參考。

3種材料的多個(gè)形態(tài)學(xué)性狀和品質(zhì)性狀差異顯著。其中，‘YYS-4’材料單株產(chǎn)量水平最高(297 g)，‘豫油莎2號(hào)’和‘豫油莎3號(hào)’分別為113.46 g和90.65 g；‘豫油莎3號(hào)’是典型的細(xì)葉、多分蘗類(lèi)型材料，‘豫油莎2號(hào)’則表現(xiàn)為典型的寬葉型材料。從品質(zhì)方面看，‘豫油莎3號(hào)’可溶糖達(dá)到了21.30%，是高糖型品種，‘豫油莎2號(hào)’和‘YYS-4’材料分別是高油型和高淀粉型材料。

光合作用是植物的生命之源，能較好地說(shuō)明該物種對(duì)光、溫、水氣等環(huán)境資源的轉(zhuǎn)化效率[14]。本研究結(jié)果顯示，‘豫油莎2號(hào)’在光合參數(shù)方面表現(xiàn)較為突出，其葉片凈光合速率在3類(lèi)粒型中最高，顯示了該材料較高的產(chǎn)量潛力。目前，油莎豆的光合相關(guān)性狀研究國(guó)內(nèi)外正式報(bào)道較少，本結(jié)果可為后續(xù)的相關(guān)研究提供參考。

Roalson[8]對(duì)莎草科的31屬851種的染色體數(shù)目研究進(jìn)行了匯總，發(fā)現(xiàn)莎草科物種存在明顯的種內(nèi)染色體數(shù)目差異，31屬851種中，共發(fā)現(xiàn)4 231個(gè)不同的單倍體染色體數(shù)目，莎草科不同種的單倍體染色體數(shù)目中頻率最高的是30、28和29，其次為5、10、20和35，最高的為114條。莎草屬不同種間的單倍體染色體數(shù)分布較為分散，在8、18、32、36、40、48、52、54和56處相對(duì)集中，數(shù)目最少為6條，最多為114條[8，15-19]。油莎豆種內(nèi)同樣存在不同染色體條數(shù)的報(bào)道[8]，其中，Heiser[20]報(bào)道了一種二倍體油莎豆具有108條染色體；Suzuka等[21]發(fā)現(xiàn)了染色體數(shù)為18的二倍體材料；有的研究報(bào)告則認(rèn)定其獲得的油莎豆染色體數(shù)目為208條，同時(shí)也鑒定了單倍體的染色體為104條[8]；Rath等[8,22]報(bào)道了其發(fā)現(xiàn)的兩種材料的單倍體染色體數(shù)均為54條；Mulligan等[23]在加拿大的安大略發(fā)現(xiàn)了一種n=48的油莎豆材料。然而，Zonneveld認(rèn)為以上各報(bào)道的油莎豆染色體數(shù)目結(jié)果的準(zhǔn)確性仍有待進(jìn)一步商榷[9]。本研究通過(guò)DAPI染色和端粒探針熒光原位雜交兩種方法確認(rèn)了中國(guó)現(xiàn)有3種粒型油莎豆材料的染色體數(shù)目均為156條，這一結(jié)果與前人報(bào)道不同。其原因可能有：(1)油莎豆為無(wú)性繁殖植物，發(fā)生染色體自然加倍、著絲粒斷裂、融合等的突變后的個(gè)體相比有性繁殖植物更容易存活，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期固化、繁衍后產(chǎn)生了多樣性豐富的染色體數(shù)目類(lèi)型；(2)種內(nèi)突變株的衍生使油莎豆資源產(chǎn)生明顯的地域分化，各國(guó)學(xué)者研究選用的研究材料本身來(lái)源不同，造成了結(jié)果的差異。確切的結(jié)論需要今后更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)給予證實(shí)。