華炳紅，張菊云，鄭地明，黃辛欣

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種不同于器質(zhì)性心血管疾病的特異性心肌病變，是糖尿病的常見并發(fā)癥之一[1]。高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞因子激活與細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和微血管內(nèi)皮下纖維組織增多等方面密切相關(guān)，參與DCM發(fā)病與心肌損傷[2-3]。因此，預(yù)防和改善糖尿病患者心肌微循環(huán)纖維化和炎性損傷具有重要的臨床意義。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種腸促胰島素，可通過(guò)調(diào)控β細(xì)胞的增殖、再生和凋亡，顯著降低患者糖化血紅蛋白和體質(zhì)量，減輕炎性反應(yīng)，從而改善心肌損傷[4-5]。司美格魯肽是GLP-1的類似物，臨床研究表明，其在血糖控制和心血管疾病長(zhǎng)期預(yù)后中表現(xiàn)出良好的有效性和安全性[6]。但其對(duì)糖尿病并發(fā)癥,特別是對(duì)DCM的作用尚未可知。本研究擬分析司美格魯肽對(duì)DCM心肌結(jié)構(gòu)、炎性反應(yīng)和血管生成方面的影響及作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，8～10周齡，體質(zhì)量200～250 g，均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2019-0010。嚴(yán)格控制(25±1)℃恒溫、50%恒定濕度的標(biāo)準(zhǔn)通風(fēng)飼養(yǎng)環(huán)境，每日12 h規(guī)律明暗交替光照，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。(2)藥品與試劑：鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，司美格魯肽(上海凱試生物科技有限公司，純度99%)，HE染色試劑盒，改良Masson三色染色試劑盒(索萊寶公司)，兔抗α-平滑肌肌球蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(Abcam公司)，兔抗TNF-α抗體(Santa Cruz公司)，兔抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體(Sigma公司)，兔抗β-actin抗體(Sigma公司)，山羊抗兔IgG二抗(Abcam公司)，DAB染色液(Dako公司)。(3)儀器設(shè)備：TG16-WS/TG16WS臺(tái)式高速離心機(jī)(中國(guó)湘儀集團(tuán))；Nikon Eclipse E600倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司)；Bio-rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司);BG-102血糖儀(上海羅氏制藥有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2021年1月—2022年1月于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 60只SD大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、DCM組和干預(yù)組，每組20只。DCM組、干預(yù)組構(gòu)建DCM模型：大鼠于禁食12 h后一次性腹腔注射STZ 70 mg/kg(STZ采用0.1 mol/L、pH 4.2枸櫞酸緩沖液配置)，3 d后使用羅氏血糖檢測(cè)儀檢測(cè)小鼠血糖水平，隨機(jī)血糖大于16.67 mmol/L為糖尿病建模成功，檢測(cè)血糖，將大約6周左右發(fā)生DCM的大鼠納入實(shí)驗(yàn)[7]。對(duì)照組大鼠腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。造模成功后，干預(yù)組大鼠每日給予司美格魯肽腹腔注射給藥(10 nmol/kg，溶于0.9% NaCl溶液)，對(duì)照組和DCM組以等量生理鹽水代替，均連續(xù)干預(yù)6周。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 心肌組織病理學(xué)檢測(cè)：干預(yù)結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。脫頸處死，取出大鼠左心室標(biāo)本，部分組織置于4%多聚甲醛固定24 h以上后，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，4 μm厚度切片，行HE和Masson染色，光鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)并拍照，利用Image J計(jì)算心肌膠原體積分?jǐn)?shù)(CVF)=單視野內(nèi)膠原面積/心肌總面積×100%。

1.3.2 大鼠血糖、血脂指標(biāo)測(cè)定：末次給藥后，不禁食采集大鼠眼內(nèi)眥靜脈血，離心取上清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.3.3 心肌組織α-SMA和TNF-α表達(dá)測(cè)定：采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)。心肌石蠟切片脫蠟，抗原修復(fù)，用3%過(guò)氧化氫孵育阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，分別與兔抗α-SMA多克隆抗體(1∶1 000)和兔抗TNF-α抗體(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜。次日，與山羊抗兔IgG二抗在室溫下孵育60 min。DAB可視化顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間(1～2 min)。每組準(zhǔn)備5張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域進(jìn)行分析，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0測(cè)定有α-SMA陽(yáng)性反應(yīng)的小血管(即小血管平滑肌增厚且內(nèi)部直徑<50 μm)和TNF-α陽(yáng)性反應(yīng)百分比面積。α-SMA和TNF-α的陰性對(duì)照組以相同的實(shí)驗(yàn)方法處理，但不予抗體孵育。

1.3.4 心肌組織TNF-α和VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Western-blot法檢測(cè)心肌組織內(nèi)TNF-α和VEGF蛋白表達(dá)。冰上剪碎心肌組織，利用RIPA裂解液180 μl+蛋白酶抑制劑20 μl對(duì)組織樣本進(jìn)行勻漿，冰上裂解30 min。4℃離心取上清。BCA法檢測(cè)樣本蛋白濃度，煮沸變性。應(yīng)用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白電泳。濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，美國(guó))，8%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白1 h，分別孵以TNF-α(1∶500)和VEGF一抗(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，次日TBST洗膜3次后，二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。β-actin作為內(nèi)參，使用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)觀察比較 (1)HE染色：對(duì)照組大鼠心肌纖維形態(tài)均勻，排列規(guī)律緊密，胞核藍(lán)染清晰可見；DCM組大鼠心肌組織出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常變性，表現(xiàn)為異常胞質(zhì)空泡樣變性，心肌細(xì)胞排列疏松紊亂，肌纖維肥大斷裂；干預(yù)組大鼠經(jīng)藥物治療后，心肌結(jié)構(gòu)紊亂程度降低，心肌排列較DCM組規(guī)則，見圖1。(2)心肌Masson染色：對(duì)照組多為紅色為主的心肌纖維和藍(lán)色細(xì)胞核；DCM組大鼠心肌組織膠原纖維沉積明顯增多，相互交聯(lián)成網(wǎng)狀，排列紊亂，血管周圍纖維化明顯增多，而干預(yù)組大鼠間質(zhì)膠原纖維減少，心肌纖維化程度得到明顯改善。DCM組心肌膠原體積分?jǐn)?shù)(16.3±1.4)%高于對(duì)照組的(2.6±0.4)(t/P=42.079/<0.001)，干預(yù)組心肌膠原體積分?jǐn)?shù)(6.8±1.7)%顯著低于DCM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=19.292/<0.001)，見圖2。

注：A.對(duì)照組；B.干預(yù)組；C、D為DCM組，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞破裂(之字形箭頭)，空泡化(十字箭頭)，間質(zhì)液(雙裂箭頭)和紅細(xì)胞(粗箭頭)浸潤(rùn)

注：A.對(duì)照組；B.DCM組；C.干預(yù)組

2.2 各組大鼠血糖及血脂水平比較 DCM組大鼠血清FPG、TC、TG和LDL-C水平均高于對(duì)照組(P<0.01),而HDL-C水平則顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。干預(yù)組大鼠血清FPG、TC、TG和LDL-C水平均低于DCM組(P<0.01)，而2組HDL-C水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組大鼠血糖、血脂水平比較

2.3 各組大鼠心肌組織TNF-α和α-SMA水平比較 免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DCM組大鼠心肌細(xì)胞TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多(P<0.01)；與DCM組比較，干預(yù)組陽(yáng)性細(xì)胞降低(P<0.01),見表2、圖3。對(duì)照組心肌組織中α-SMA表達(dá)僅在微動(dòng)脈平滑肌層內(nèi)；DCM組大鼠心肌組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)；與DCM組比較，干預(yù)組心肌組織中α-SMA陽(yáng)性表達(dá)水平明顯增高，尤其是微動(dòng)脈周圍心肌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2、圖4。

表2 各組大鼠心肌TNF-α、α-SMA水平比較

注：A.陰性抗體對(duì)照，細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿呈淡藍(lán)色；B.對(duì)照組；C.DCM組，箭頭代表心肌細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒樣陽(yáng)性物質(zhì)增多，并聚合成團(tuán)；D.干預(yù)組

注：A.陰性抗體對(duì)照，細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿呈淡藍(lán)色，小動(dòng)脈側(cè)部分紅細(xì)胞呈淡藍(lán)色；B.對(duì)照組；C.DCM組；D.干預(yù)組，箭頭代表棕紅色α-SMA陽(yáng)性表達(dá)，主要集中于增厚的小動(dòng)脈平滑肌層

2.4 各組大鼠TNF-α、VEGF蛋白表達(dá)比較 Western-blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DCM組大鼠心肌TNF-α蛋白表達(dá)量明顯增高，而VEGF蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)。與DCM組比較，干預(yù)組大鼠TNF-α蛋白表達(dá)降低，而VEGF蛋白表達(dá)升高(均P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織TNF-α和VEGF蛋白表達(dá)比較

3 討 論

當(dāng)前全球糖尿病患病率逐年升高，且因血糖控制效果不佳，常伴隨不同程度并發(fā)癥，給患者生活質(zhì)量帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。高血糖作為糖尿病基本病因，可誘發(fā)多個(gè)系統(tǒng)和器官損害，也可介導(dǎo)炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和心肌纖維化，是引起DCM的重要危險(xiǎn)因素，且糖尿病患者通常伴有高脂血癥，亦可增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[8]。GLP-1是一類治療2型糖尿病的新型藥物，可通過(guò)調(diào)節(jié)β細(xì)胞的增殖、再生和凋亡來(lái)增強(qiáng)胰島素分泌、模擬胰島素作用并抑制胰高血糖素，發(fā)揮降糖效果并改善血管內(nèi)皮功能障礙，而司美格魯肽作為一種腸道分泌GLP-1類似物可能具有類似效果[9]。多項(xiàng)臨床研究表明，司美格魯肽可有效升高患者心肌梗死后的存活率，改善糖尿病患者心臟功能[6]。本研究結(jié)果顯示，司美格魯肽治療可顯著改善DCM組大鼠的高血糖和高血脂狀態(tài)，說(shuō)明司美格魯肽對(duì)糖尿病患者具有明顯的降糖調(diào)脂作用，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Kraljevic等[10]進(jìn)行的研究結(jié)果部分一致，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

DCM是與糖尿病特有代謝紊亂有關(guān)的一種特異性心肌病變[11-12]。能量代謝紊亂引起的細(xì)胞因子和電生理改變，對(duì)心肌結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損傷。多項(xiàng)研究表明，GLP-1類藥物和GLP-1受體激動(dòng)劑(glucagon-like peptide-1 receptor agonists，GLP-1RA)具有調(diào)節(jié)心肌纖維化作用，可改善糖尿病患者的心血管功能[13-15]。此外，其還可通過(guò)抑制炎性介質(zhì)(血清TNF-α、IL-6和IL-1β)、氧化應(yīng)激及P38、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路以緩解大鼠DCM[16]。本研究病理組織結(jié)構(gòu)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DCM組大鼠心肌組織出現(xiàn)大量間質(zhì)纖維化、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、凋亡細(xì)胞增多和紅細(xì)胞異常分布等組織損傷。研究已證實(shí)，DCM發(fā)展過(guò)程中，抗氧化因子在心臟組織中急劇下降，持續(xù)增長(zhǎng)的ROS刺激轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/Smad3信號(hào)通路激活，從而促進(jìn)幾種關(guān)鍵纖維化標(biāo)志物的表達(dá)，如DCM心臟中的α-SMA、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原[17-18]。本研究以尾靜脈一次性注射大劑量STZ構(gòu)建DCM模型，大鼠出現(xiàn)DCM典型生化指標(biāo)表現(xiàn)，包括高血糖和高血脂等，說(shuō)明模型構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STZ誘導(dǎo)的DCM大鼠心肌微動(dòng)脈平滑肌層內(nèi)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)明顯降低，提示由成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化增加，導(dǎo)致DCM心肌病理改變和心臟功能障礙，而干預(yù)組司美格魯肽治療則可顯著增加DCM大鼠心肌微動(dòng)脈內(nèi)膜α-SMA表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞變性，緩解DCM大鼠心肌纖維化。以上結(jié)果提示，司美格魯肽可顯著改善DCM大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)病理改變，在結(jié)構(gòu)和分子水平上阻止心肌細(xì)胞的退行性改變。

TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，具有多種生物學(xué)活性，活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量TNF-α可介導(dǎo)炎性免疫損傷[19]。Palomer等[20]最近的研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠心肌組織TNF-α的表達(dá)顯著增高，其水平與心肌纖維化程度和心室肌重量呈正相關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，司美格魯肽可通過(guò)抗炎機(jī)制顯著降低NF-κB、TNF-α和IL-1β等炎性因子的表達(dá)水平，抑制ApoE-/-小鼠和LDLr-/-小鼠的斑塊病變發(fā)展，這種改變?cè)谝欢ǔ潭壬吓c血糖、體質(zhì)量和膽固醇降低無(wú)關(guān)[21-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DCM模型大鼠心肌組織TNF-α蛋白表達(dá)顯著升高；同時(shí)，免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞內(nèi)TNF-α陽(yáng)性棕黃色顆粒樣物質(zhì)增多，并聚合成團(tuán)?？梢奣NF-α參與了DCM病變的發(fā)展。此外，司美格魯肽治療可顯著降低DCM大鼠心肌組織TNF-α的表達(dá)和聚集，這表明司美格魯肽可通過(guò)抑制炎性反應(yīng)發(fā)揮DCM心肌保護(hù)作用，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[20]。

VEGF作為一種有效的血管生成因子，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)血管的發(fā)育，其在糖尿病患者中的表達(dá)降低可能是糖尿病患者心肌梗死高風(fēng)險(xiǎn)的重要因素之一[24]。Maskery等[25]發(fā)現(xiàn)，GLP-1受體激動(dòng)劑可減少腦梗死患者梗死面積、凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，并促使血管新生因子VEGF表達(dá)的上調(diào)，繼而增加神經(jīng)和血管新生。本研究結(jié)果表明，司美格魯肽治療可顯著增加大鼠心肌組織VEGF表達(dá)，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈微血管新生，對(duì)DCM心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，司美格魯肽可明顯改善DCM大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)病理改變，它在結(jié)構(gòu)和分子水平上可阻止心肌細(xì)胞的退行性改變，對(duì)DCM組大鼠的心肌纖維化和炎性反應(yīng)有明顯的保護(hù)作用，并且可促進(jìn)冠狀動(dòng)脈血管新生。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

華炳紅：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫；張菊云：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;鄭地明：資料搜集整理，論文修改;黃辛欣：課題設(shè)計(jì)，分析整理