楊成 喬云龍 厲榮玉 熊延靖 湯興麗

[1.皖南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，蕪湖 241002；2.活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(皖南醫(yī)學(xué)院)，蕪湖 241002；3.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，蕪湖 241002]

白念珠菌(Candidaalbicans)，一種雙相型真菌條件致病菌，通常不會引起臨床癥狀，當(dāng)應(yīng)用廣譜抗生素、激素和免疫抑制劑等造成機(jī)體免疫力下降時(shí)，可引起皮膚、黏膜等淺表感染，甚至侵犯深部組織和器官引發(fā)全身性感染，造成念珠菌病[1-5]。目前，臨床上所用的抗真菌藥物種類有限且長期大量使用會產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象及毒副作用[6-8]。因此，在高效低毒抗真菌藥物匱乏的情況下，亟待尋求和開發(fā)新型安全有效的抗真菌藥物[9]。筆者前期研究分離到1株對白念珠菌具有明顯拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，而通常芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中往往含有抗菌肽類活性物質(zhì)，它們能夠造成細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄而具有廣譜抗菌、抗病毒、抗原蟲和抗腫瘤等活性[10-11]。因此，本文以白念珠菌為指示菌，對菌株Y6抗菌肽類代謝物抑制白念珠菌及其作用機(jī)理進(jìn)行初步研究，這不僅為抗真菌藥物的開發(fā)提供了新的方向，同時(shí)也為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用抗真菌活性肽提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株：白念珠菌(ATCC10231)購自上海魯微科技有限公司；貝萊斯芽孢桿菌Y6由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，高壓滅菌121℃、15 min；液體種子/發(fā)酵培養(yǎng)基(液體PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃、15 min；沙堡弱液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃、15 min。

試劑和儀器 麥?zhǔn)媳葷峁?北京威泰科生物有限技術(shù)公司)，碘化丙啶(PI)(合肥博美生物有限公司)，牛津杯(南京泰勒生物儀器有限公司)，薄層色譜板(TLC)(德國Merk公司)，薄層色譜制備板(青島海洋)，ESCD CLASSⅡBSC生物安全柜(Airstream)；GWP-P80A型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(合肥華德利科學(xué)器材有限公司)，奧林巴斯IX71FL倒置熒光顯微鏡(日本)，冷凍離心機(jī) (BECKMAN COULTER Allegra 64R Centrifuge)，恒溫水浴震蕩培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，F(xiàn)reeze Dry Systems(美國LABCONCO公司)。

1.2 方法

白念珠菌菌液的制備 挑取少許白念珠菌斜面接種于沙堡弱液體培養(yǎng)基中，于37℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，3 000 r/min離心5 min，將菌體沉淀懸浮于無菌蒸餾水中，將其濃度調(diào)整至1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬? ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

貝萊斯芽孢桿菌Y6代謝物制備及活性測定取斜面菌種1環(huán)到PDA 種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min，20 h，按照10% 的接種量接入裝有 200 mL PDA 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL 搖瓶中，37 ℃、180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液在 4 ℃下12 000 r/min離心30 min，去菌體收集上清液，121 ℃滅菌處理15 min后將上清液經(jīng)0.22 μm過濾后冷凍干燥備用。

抗菌活性的測定 將1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝话啄钪榫脽o菌棉棒直接涂布于PDA平板中，然后放入牛津杯，并讓其自然下沉后，將凍干品制成濃度為10 mg·mL-1作為測試品，吸取100 μL至牛津杯，輕輕移至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以無菌水溶液為對照，觀察抑菌圈，并測量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，取平均值作為該樣品抑菌結(jié)果；菌株拮抗性采用點(diǎn)接法，直接挑取菌株Y6點(diǎn)接于上述涂有白念珠菌PDA平板中，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)抑菌環(huán)。

最小抑菌濃度(MIC)的測定 取上述濃度為1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝话啄钪榫蒙潮と跻后w培養(yǎng)基稀釋100倍后，取1 mL，向其中加入10 mg 菌株Y6代謝物，然后采用梯度稀釋，使Y6代謝物的終濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125 mg·mL-1，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，取50 μL白念珠菌懸液涂布于PDA平板中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，觀察各平板上白念珠菌生長情況，以沒有白念珠菌菌落出現(xiàn)來確定MIC，重復(fù)3次。

菌株Y6代謝物中活性成分的篩檢及活性的檢測 將上述貝萊斯芽孢桿菌Y6代謝物凍干品用甲醇抽提，離心取上清液作為測試樣品， 參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行試驗(yàn)，點(diǎn)樣后在三氯甲烷∶甲醇∶水=15∶7∶2展開劑中展開，自然揮發(fā)干，在254 nm標(biāo)記出被分離物質(zhì)斑點(diǎn)位置，用制備板將各組分進(jìn)行分離制備，將收集的組分用甲醇抽提點(diǎn)樣跑板，254 nm下觀察分離效果，然后用0.4%茚三酮乙醇溶液顯色。采用濾紙片法對制備的活性成分進(jìn)行抗菌活性測定，以甲醇為對照，觀察各組分對白念珠菌的活性。

菌株Y6抗菌肽對白念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響 參照文獻(xiàn)[13-14]方法進(jìn)行，取1個(gè)麥?zhǔn)蠞舛劝啄钪榫鷳乙?，用沙堡弱液體培養(yǎng)基稀釋100倍后，加入菌株Y6抗菌肽，使其終濃度為0.5 MIC作為實(shí)驗(yàn)組，無菌水為對照組，將其置于搖床37℃ 150 r/min 進(jìn)行培養(yǎng)，于0、4、8、12 h取出3 mL，5 000 r/min 離心10 min 分別收集上清液和菌體沉淀。其中上清液直接測量其在波長為260 nm和280 nm的吸光值，考察Y6代謝物對白念珠菌細(xì)胞內(nèi)大分子(核酸OD260、蛋白質(zhì)OD280)釋放情況的影響。菌體沉淀用PBS 緩沖液洗滌3 次，離心棄上清，用沙堡弱液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀使其體積為200 μL，加入PI溶液，使混合液中 PI的終濃度達(dá)到20 μg·mL-1，混勻后4℃避光染色10 min，離心取菌液涂片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，采用方差分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 貝萊斯芽孢桿菌Y6代謝物對白念珠菌的抑制作用

Y6代謝物對白念珠菌抑制效果見圖1所示，從測試結(jié)果可以看出，菌株Y6代謝物對供試的白念珠菌表現(xiàn)出有良好的抑制效果，當(dāng)測試濃度為10 mg·mL-1，抑制圈直徑分別為(38.2±0.5)mm，而左側(cè)無菌水對照組沒有出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象(見圖1A)；圖1B顯示該菌株在PDA培養(yǎng)基對白念珠菌的拮抗性試驗(yàn)結(jié)果，菌株Y6菌落周圍出現(xiàn)明顯抑菌圈，直徑平均為(27.8±0.4)mm；圖1C是將菌株、代謝物及無菌水對照在同一平皿中對白念珠菌的抑制活性結(jié)果。通過上述活性測定結(jié)果，表明菌株Y6對供試白念珠菌明顯的抑制作用。

圖1 菌株Y6代謝物抑菌白念珠菌的效果 圖2 菌株Y6抗菌活性組分的篩檢及抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of metabolites of strain Y6 on C. albicansFig.2 Screening and antifungal effect of antimicrobial active components of strain Y6

2.2 最小抑菌濃度的測定

在最小抑菌濃度測定中，當(dāng)菌株Y6代謝物濃度在10～0.625 mg·mL-1時(shí)，平板上未見白念珠菌菌落出現(xiàn)，隨著加入菌株Y6代謝物濃度減小到終濃度為0.3125 mg·mL-1時(shí)開始出現(xiàn)少量菌落，據(jù)此初步判斷，菌株Y6代謝物對白念珠菌的MIC為 0.625 mg·mL-1。

2.3 抗菌組分的分離純化及其活性測試

在展開劑為三氯甲烷∶甲醇∶水=15∶7∶2條件下展開，測試樣品初步分離情況如圖2A(原)所示，其中1～5為制備后甲醇抽提組分，圖2B所示為各分離組分0.4%茚三酮顯色板。從A圖結(jié)果可知，254 nm下測試樣品(原)可見5個(gè)明顯的斑點(diǎn)，分別對應(yīng)制備分離后的樣品(1～5)，只是4、5組分純度更高，可見單一的斑點(diǎn)，而1～3組分有拖尾現(xiàn)象。而上述各組分經(jīng)0.4%茚三酮顯色后，組分1～3均呈現(xiàn)紫紅色斑點(diǎn)，說明1～3組分為肽類物質(zhì)，只是純度不高，而紫外254 nm下相對較純的4、5組分卻沒有產(chǎn)生紫紅色斑點(diǎn)，表明組分4、5可能為非肽類物質(zhì)。而圖2C中抗菌活性測試結(jié)果表明制備組分中有2個(gè)抗菌活性組分，分別為組分2和組分5，其中2組分為主要活性部分，組分5僅僅顯示微弱的抗菌活性，組分1、3、4及甲醇對照均沒有抗菌活性，結(jié)合茚三酮顯色結(jié)果，可以初步推斷菌株Y6代謝物中抗菌成分主要為肽類物質(zhì)。

2.4 菌株Y6抗菌肽對白念珠菌胞內(nèi)大分子釋放量的影響

細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)通常不能透過細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外，但如果細(xì)胞膜受損，胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)就可能會泄漏到細(xì)胞外，因此，通過檢測經(jīng)上清液在260 nm和280 nm處吸光度的變化來判斷胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏情況，結(jié)果見圖3所示，隨著作用時(shí)間的延長，處理組OD260 nm和OD280 nm吸光值明顯高于對照組OD260 nm和OD280 nm吸光值，表明代謝物對胞內(nèi)大分子釋放量存在一定的影響，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FOD260 nm=13.822、FOD280 nm=10.549，P<0.05)，表明菌株Y6抗菌肽對白念珠菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成一定的影響，引起膜內(nèi)物質(zhì)泄漏到胞外，進(jìn)而達(dá)到誘使菌體死亡的目的。

圖3 抗菌肽對胞內(nèi)大分子釋放量的影響. A. 核酸釋放量；B. 蛋白質(zhì)釋放量Fig.3 Effect of antimicrobial peptide on intracellular macromolecule release. A. The amount of nucleic acid released; B. The amount of protein released

2.5 PI熒光標(biāo)記檢測菌株Y6抗菌肽對白念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響

由于許多芽孢桿菌抗菌肽類代謝物能通過誘導(dǎo)細(xì)胞膜完整性的變化來實(shí)施其生物學(xué)活性，PI熒光染料不能穿過完整的細(xì)胞膜，但可滲透到膜受損的細(xì)胞內(nèi)，并與核酸結(jié)合，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，所以可用PI染料來檢測細(xì)胞膜的完整性。菌株Y6抗菌肽對白念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響結(jié)果如圖4所示。對照組由于未加抗菌肽處理，菌體細(xì)胞膜仍處于完整狀態(tài)，因此PI染料無法進(jìn)入，熒光顯微鏡下除個(gè)別細(xì)胞外顯紅光外，絕大多數(shù)菌體細(xì)胞無紅光出現(xiàn)(見圖4對照組)，說明此狀態(tài)下，由于個(gè)別白念珠菌細(xì)胞死亡胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而絕大多數(shù)白念珠菌細(xì)胞膜通透性并沒有發(fā)生改變，使得PI進(jìn)入個(gè)別死亡細(xì)胞內(nèi)而呈顯紅光；而經(jīng)抗菌肽處理后，隨著處理時(shí)間的變化，菌體細(xì)胞出現(xiàn)了的紅光信號(見圖4 處理組)，說明經(jīng)抗菌肽處理后，白念珠菌細(xì)胞膜的完整性遭到一定程度的破壞。

圖4 菌株Y6抗菌肽對白念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響(1、2 分別為明視野和相同位置熒光視野可觀察到的熒光顯微鏡圖，×400)Fig.4 Effect of antimicrobial peptide from strain Y6 on membrane integrity of C.albicans(1 and 2 are fluorescence microscopes that can be observed in the bright field and the same position，×400)

3 討 論

近年來真菌感染的發(fā)病率上升，真菌耐藥性亦有增加，可用抗真菌藥物的數(shù)量有限，使得研發(fā)新型安全、有效的抗真菌藥物更為迫切[15]。抗菌肽是一類具有抗菌活性的多肽類小分子，分布廣泛，結(jié)構(gòu)簡單，不僅對細(xì)菌有很強(qiáng)的殺傷作用，而且對真菌、病毒、寄生蟲及腫瘤細(xì)胞等都有一定的殺滅活性[16-17]。本實(shí)驗(yàn)以探究貝萊斯芽孢桿菌Y6代謝物對白念珠菌抑菌效果為目的，進(jìn)而研究抗菌的作用機(jī)理，結(jié)果表明，通過牛津杯法，貝萊斯芽孢桿菌Y6代謝物對白念珠菌表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，當(dāng)代謝物測試濃度度為10 mg·mL-1，抑制圈直徑為(38.2±0.5)mm，其MIC 為 0.625 mg·mL-1，結(jié)合平板對峙法發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌Y6對白念珠菌也表現(xiàn)出明顯的拮抗性，菌落周圍抑菌環(huán)直徑達(dá)到(27.8±0.4)mm。為了進(jìn)一步探究菌株Y6代謝提取物對白念珠菌的抑制效果，采用薄層色譜法對代謝物中的抗菌成分進(jìn)行初步分離純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株Y6代謝物在薄層板上254 nm下顯示出5個(gè)明顯的斑點(diǎn)且在茚三酮作用下1～3號分離組分呈紫色，4～5號沒有顯出顏色，推斷Y6代謝產(chǎn)物1～3號為肽類代謝物，而4～5號組分為非肽類物質(zhì)；通過抑菌活性測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)代謝物中有2號組分對白念珠菌具有非常顯著的抑制作用，綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明Y6代謝物中主要對白念珠菌產(chǎn)生抑制作用為肽類代謝物。由此推測該肽類抗菌活性可能與其損傷細(xì)胞膜作用有關(guān)，通過大分子釋放量及PI熒光染色考察抗菌肽物質(zhì)對白念珠菌細(xì)胞膜完整性的影響，通常細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)不能透過細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外，但如果細(xì)胞膜受損，胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)就可能會泄漏到胞外，因此，通過檢測大分子釋放量可以間接了解細(xì)胞膜的損傷程度，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株Y6抗菌肽類代謝物能增加胞內(nèi)大分子釋放量，這一結(jié)果與郭娟等[13]所描述的“抗菌肽P-1可引起粉紅單端孢細(xì)胞膜通透性增加，胞內(nèi)大分子物質(zhì)外泄”結(jié)論相似。PI為一種核酸染料，一般不能進(jìn)入具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞膜通透性增加或細(xì)胞死亡時(shí)，它能進(jìn)入細(xì)胞與核酸特異性結(jié)合，發(fā)出紅棕色熒光，結(jié)合越多PI，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，PI攝入試驗(yàn)結(jié)果與蔡蜨等[14]報(bào)道結(jié)果相似，通過熒光顯微鏡觀察，還發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗菌肽處理可破壞白念珠菌細(xì)胞膜，使PI 熒光染色劑進(jìn)入菌體內(nèi)與核酸物質(zhì)結(jié)合，發(fā)出紅光，通過大分子釋放量變化及PI攝入量的變化實(shí)驗(yàn)，都表明抗菌肽類代謝物處理后白念珠菌胞膜完整性受到一定程度的影響。由此推測，貝萊斯芽孢桿菌Y6抗菌肽類代謝物對白念珠菌具有抑制活性，且該活性與其對白念珠菌胞膜的破壞之間存在密切的關(guān)系。