彭卓穎 廖勇 巴根 楊鑫 張騫宇 楊蓉婭

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心皮膚科，北京 100700)

微進(jìn)化(microevolution)指的是種內(nèi)或近緣物種之間的進(jìn)化，當(dāng)病原菌引起宿主組織損傷的同時(shí)，宿主也會(huì)對(duì)菌株的基因型及表型產(chǎn)生壓力選擇，病原菌可以通過微進(jìn)化快速適應(yīng)這種壓力[1]。阿薩希毛孢子菌(T.asahii)屬于機(jī)會(huì)性致病真菌，可定植于人體的皮膚、呼吸道黏膜和胃腸道等部位[2]。本課題組曾于2000年發(fā)現(xiàn)1名病史長(zhǎng)達(dá)24年的慢性播散性毛孢子菌感染患者，并分離到阿薩希毛孢子菌原代菌株TO[3]，該患者后期的抗真菌藥物治療效果不佳，皮損遷延不愈，14年后在其皮損處再次分離到菌株，經(jīng)基因序列對(duì)比確認(rèn)為阿薩希毛孢子菌，命名為TEVO。目前圍繞病原真菌微進(jìn)化與宿主免疫相互作用的研究多集中于體外實(shí)驗(yàn)[4-5]，無法有效進(jìn)行微進(jìn)化與天然免疫識(shí)別等方面的研究。因此，本研究主要利用微進(jìn)化前后的阿薩希毛孢子菌建立小鼠系統(tǒng)性感染模型，旨在明確微進(jìn)化對(duì)菌株感染宿主能力以及機(jī)體免疫等方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌株 微進(jìn)化株TEVO來源于2014年患者復(fù)診時(shí)的頸部皮損，現(xiàn)保存于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心皮膚科實(shí)驗(yàn)室，菌藏號(hào)：BM1403。阿薩希毛孢子菌原代株TO來源于2000年患者首診時(shí)的面部皮損，凍存于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌藏號(hào)：AS2.2174。基因測(cè)序結(jié)果顯示，阿薩希毛孢子菌TEVO和TO的rRNA大亞基D1/D2區(qū)域堿基序列與標(biāo)準(zhǔn)株(CBS2479)完全相同。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c近交系雄性小鼠30只，周齡5周，平均體重為20 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006)。

主要試劑 TaqMan?Gene Expression Master Mix購(gòu)于Life technologiesTM，PCR引物與探針均合成于InvitrogenTM公司，(1,3)-Beta-D-Glucan Detection Reagent Kit購(gòu)于GLUCATELL?，PE/Cy7 anti-mouse CD3 antibody、PE anti-mouse CD8a antibody、FITC anti-mouse CD4 antibody購(gòu)于Biolegend，Cyclophosphamide購(gòu)于MedChem Express。

1.2 方法

菌株復(fù)蘇與菌落形態(tài)觀察 將凍存于-80℃的TEVO和TO復(fù)溫，取一定量菌液接種于10 mL YPD培養(yǎng)基中，置于35℃搖床中培養(yǎng)至產(chǎn)生大量孢子。分別取適量菌液接種到PDA固體培養(yǎng)基中，放于35℃孵箱中培養(yǎng)，每天觀察菌落形態(tài)變化。

菌株光學(xué)形態(tài)與電鏡形態(tài)觀察 將PDA培養(yǎng)基中的菌落挑取適量，用無菌生理鹽水配成1×108個(gè)/mL菌懸液，各取1 μL菌懸液用乳酸酚棉藍(lán)染色，隨后用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。將挑取的TEVO和TO菌落用固定液固定4 h，用PBS溶液洗3次后浸泡于1%鋨酸溶液，2 d后分別用50%、75%、95%和100%的乙醇各脫水10 min，然后在醋酸異戊酯中置換20 min，最后在掃描電鏡下進(jìn)行觀察。

小鼠感染模型的構(gòu)建 將小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，TEVO組、TO組與對(duì)照組各10只小鼠，每只小鼠腹腔注射200 mg/kg環(huán)磷酰胺，免疫抑制3 d后，實(shí)驗(yàn)組分別于小鼠尾靜脈注射5×107CFU/mL對(duì)應(yīng)菌懸液0.3 mL；對(duì)照組小鼠尾靜脈注射0.3 mL生理鹽水。分別于感染D3和D6將每組隨機(jī)選取5只小鼠進(jìn)行眼球取血與組織解剖。將所得血漿進(jìn)行葡聚糖檢測(cè)；將所獲取的組織做成組織勻漿，一部分用SYBR Green熒光染料進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)組織載量[6]，另一部分進(jìn)行MPO檢測(cè)；其中脾臟留取部分新鮮組織進(jìn)行研磨，將所得脾細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行圖表制作及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05則表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TEVO與TO的形態(tài)差異比較

TEVO菌落為較干燥的乳白色圓形菌落，其菌落邊緣較光滑，表面皺褶細(xì)小呈絨毛樣(見圖1A);TO菌落同樣較干燥，呈乳白色圓形，但其邊緣較毛糙，表面皺褶粗大呈腦回樣(見圖1B)。光鏡和電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，TEVO菌株基本為孢子形態(tài)，僅可觀察到少量菌絲(見圖1C、E)，而TO以菌絲形態(tài)為主，僅存在少量關(guān)節(jié)孢子(見圖1D、F)。

2.2 感染小鼠臟器載量結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)利用熒光定量PCR的方法檢測(cè)感染小鼠各組織中TEVO和TO的相對(duì)基因表達(dá)量。內(nèi)參基因選取的是GAPDH，最終通過△△Ct法對(duì)樣本之間目的基因的表達(dá)差異進(jìn)行比較分析。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)TEVO組小鼠各器官檢測(cè)到的載量均低于TO組，其中肝臟和脾臟中兩者的差異最顯著；第6天所得腦組織中目的基因的相對(duì)表達(dá)量均高于第3天獲取的腦組織，而在其余臟器中這種趨勢(shì)則相反，其中心臟和肺兩個(gè)組織中第6天所檢測(cè)到的目的基因的相對(duì)表達(dá)量明顯低于第3天。

2.3 小鼠血漿 (1,3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)

D3和D6解剖的健康對(duì)照組小鼠血漿(1,3)-β-D-葡聚糖濃度平均值均小于20 pg/mL，呈陰性。D3解剖的TEVO和TO組小鼠血漿(1,3)-β-D-葡聚糖濃度分別為(33.32±0.33)pg/mL和(37.99±1.37)pg/mL，從圖3統(tǒng)計(jì)圖中可看出兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P= 0.0424)；D6解剖的小鼠血漿中葡聚糖濃度分別為(31.21±0.64)pg/mL和(34.43±0.71)pg/ml，TEVO組濃度同樣低于TO組，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.0415)。

圖3 小鼠血漿葡聚糖檢測(cè)分析. A、B. D3和D6解剖小鼠所獲取血清的葡聚糖檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)檢測(cè)試劑盒推薦界值，濃度大于20 pg/mL為陽(yáng)性，否則為陰性Fig.3 Detection the (1,3)-β-D-glucan of mice plasma. A、B. The glucan test results of mice serum obtained in D3 and D6 according to the recommended cut-off value of the test kit, when the concentration above 20 pg/mL is deemed to positive, otherwise it is negative

2.4 小鼠組織髓過氧化物酶(MPO)檢測(cè)

將獲取的不同組小鼠組織進(jìn)行MPO檢測(cè)，具體檢測(cè)數(shù)據(jù)可見表1，觀察表中數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)在各組小鼠組織中腦部髓過氧化物酶的分泌均明顯低于其它器官。從圖4統(tǒng)計(jì)圖中可以看出，D3和D6兩次解剖所獲取組織中TEVO組分泌的MPO均明顯低于TO組相應(yīng)的器官，而且D6檢測(cè)到的MPO的量較D3均有不同程度的上升。

圖4 小鼠各組織MPO檢測(cè)分析。將D3和D6所解剖小鼠組織制成勻漿，其中腦組織制成10%勻漿，其余組織制成5%勻漿，然后利用MPO試劑盒對(duì)其進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)Fig.4 The results of MPO in mice tissues. The mice tissues acquired in D3 and D6 were made into homogenate, the brains were made into 10% homogenate, and others were made into 5% homogenate, then use the MPO kit to test

表1 不同組小鼠各組織MPO檢測(cè)結(jié)果(U/克組織濕重)

2.5 脾臟細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析

D3解剖的對(duì)照組小鼠脾臟細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞所占比例為(33.35±1.34)%，而TEVO組與TO組則分別降至(19.20±0.42)%和(16.10±0.42)%；同樣，對(duì)照組小鼠脾臟細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞所占比例為(10.10±0.42)%，TEVO組與TO組分別降至(7.71±0.04)%和(6.60±0.16)%。

D6解剖的TEVO和TO的CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞與D3相比均有不同程度的上升，但仍均低于正常對(duì)照組(見圖5)。

圖5 小鼠脾臟細(xì)胞流式檢測(cè). A. 流式檢測(cè)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)代表CD3抗體、縱坐標(biāo)分別代表CD4或CD8抗體，第一象限結(jié)果代表CD3+CD4+T細(xì)胞或者CD3+CD8+T細(xì)胞； B. 各組小鼠脾臟流式結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖Fig.5 Analysing mice spleen cells by Flow cytometry. The abscissa in Fig.5A represent CD3 antibody and the ordinate represent CD4 or CD8 antibody, respectively. The first quadrant represent CD3+CD4+T cells or CD3+CD8+T cells. Fig.5B is the statistical graph of spleen cells

3 討 論

病原真菌微進(jìn)化研究的關(guān)鍵問題是尋找合適的研究模型。慢性感染過程中抗真菌藥物的使用和宿主內(nèi)環(huán)境等方面因素都為菌株的微進(jìn)化提供了動(dòng)力[5]，而大多數(shù)真菌感染病例都是急性或亞急性發(fā)病，沒有經(jīng)過長(zhǎng)期的宿主免疫和抗真菌藥物的壓力性選擇，即使有慢性感染病例也因難以進(jìn)行長(zhǎng)期的跟蹤隨訪，而未能獲取微進(jìn)化菌株。本課題組在同一慢性患者身上所獲取的兩株阿薩希毛孢子菌的時(shí)間間隔長(zhǎng)達(dá)14年，是真菌微進(jìn)化研究中無法替代的理想模型。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)微進(jìn)化后的TEVO可通過改變胞外分泌酶譜、降低部分毒力以及增強(qiáng)耐藥性等方式適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境，這給菌株與宿主長(zhǎng)期共存創(chuàng)造了良好的條件[7]。但T.asahii侵入機(jī)體后能否致病不僅與其毒力等因素有關(guān)，同樣與機(jī)體自身的免疫防御狀態(tài)有關(guān)，目前報(bào)道的播散性毛孢子菌病多是繼發(fā)于白血病或惡性腫瘤等疾病[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)在微進(jìn)化過程中，T.asahii從以菌絲為主的生長(zhǎng)形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐枣咦有螒B(tài)為主，這與白念珠菌形態(tài)特征的變化較相似[4，9]。菌絲和關(guān)節(jié)孢子是構(gòu)成生物膜的主要結(jié)構(gòu)，而生物膜不僅與T.asahii的毒力和耐藥機(jī)制有關(guān)，還與宿主的免疫逃逸機(jī)制密切相關(guān)[10-11]。因此我們進(jìn)一步研究了微進(jìn)化前后菌株對(duì)宿主的感染能力以及宿主免疫系統(tǒng)對(duì)這兩株菌的防御和殺傷作用之間的差異。

首先通過對(duì)小鼠組織勻漿進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同臟器中TEVO組目的基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于TO組，說明TEVO菌株感染的小鼠器官中的菌量明顯低于TO組小鼠；而且TEVO組小鼠血漿(1,3)-β-D-葡聚糖的濃度同樣低于TO組，其中(1,3)-β-D-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要成分，當(dāng)真菌被巨噬細(xì)胞吞噬后會(huì)將其釋放入血液循環(huán)，(1,3)-β-D-葡聚糖的濃度與感染真菌的數(shù)量呈正相關(guān)，也就是說其濃度越高說明感染的菌量越多[12]。以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以充分說明微進(jìn)化后的菌株TEVO對(duì)小鼠的侵襲力明顯低于TO菌株。結(jié)合微進(jìn)化前后菌株形態(tài)的變化考慮，當(dāng)TO進(jìn)化為TEVO之后，菌絲形成減少，使其生物膜的功能嚴(yán)重受損，最終造成TEVO對(duì)宿主的侵襲力降低。

隨后本研究對(duì)微進(jìn)化與宿主免疫之間的相互作用方面做了進(jìn)一步探索，主要研究了固有免疫和適應(yīng)性免疫兩方面內(nèi)容。在固有免疫方面發(fā)揮重要作用的是吞噬細(xì)胞，吞噬細(xì)胞的MPO氧化系統(tǒng)在宿主防御以及殺滅真菌方面起著十分重要的作用[13]。本實(shí)驗(yàn)中TEVO組小鼠各器官分泌的MPO均明顯低于TO組，此結(jié)果說明當(dāng)菌株感染小鼠后，小鼠機(jī)體對(duì)TEVO菌株的防御以及殺傷反應(yīng)比對(duì)TO菌株的反應(yīng)要弱很多。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)微進(jìn)化菌株TEVO與原代株TO相比分泌蛋白酶的活性明顯降低，而且不能分泌磷脂酶[7]，其中蛋白酶主要是降解對(duì)維持機(jī)體生理功能有重要作用的蛋白，磷脂酶則會(huì)破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致脂質(zhì)釋放[14-16]。同樣有觀點(diǎn)認(rèn)為新生隱球菌在人類感染過程中發(fā)生的微進(jìn)化有利于菌株在宿主體內(nèi)發(fā)生免疫逃逸，從而導(dǎo)致持續(xù)性的感染，這主要與菌株表型的變化有關(guān)[17]。因此考慮兩株T.asahii菌株感染小鼠后，固有免疫反應(yīng)的差異應(yīng)該與菌株表型的變化密切相關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

與固有免疫的研究結(jié)果不同，TEVO組和TO組小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞與對(duì)照組相比均出現(xiàn)明顯降低。由于對(duì)照組同樣注射了環(huán)磷酰胺，因此排除了免疫抑制造成的影響；而且通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，TEVO組的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞均高于TO實(shí)驗(yàn)組，結(jié)合本研究中MPO的結(jié)果分析，脾臟中T細(xì)胞的降低可能是因?yàn)楦腥厩捌诠逃忻庖呒?xì)胞數(shù)量增加，造成T細(xì)胞所占比例出現(xiàn)降低，這也說明在T.asahii感染初期主要通過固有免疫對(duì)菌株發(fā)揮防御和殺傷作用。同樣有研究表明，在阿薩希毛孢子菌感染小鼠初期調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例并未發(fā)生明顯變化，在感染后期調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例才會(huì)逐漸增加[18]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在發(fā)揮免疫抑制作用的同時(shí)也會(huì)減弱機(jī)體清除病原菌的能力，為T.asahii的存活提供了有利條件，這與其分泌的細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1有一定關(guān)系[19-20]。因此在后續(xù)的適應(yīng)性免疫研究中有必要延長(zhǎng)菌株對(duì)小鼠的感染時(shí)間，并且進(jìn)一步研究T細(xì)胞分型以及相關(guān)細(xì)胞因子在微進(jìn)化菌株感染過程中的具體作用機(jī)制。

綜上所述，微進(jìn)化后的阿薩希毛孢子菌TEVO的形態(tài)發(fā)生較大變化，由以菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐枣咦訝顟B(tài)為主，且TEVO菌株對(duì)小鼠的感染能力以及機(jī)體對(duì)TEVO的防御和殺滅作用均降低，這與微進(jìn)化后菌株表型的變化密切相關(guān)。微進(jìn)化帶來的改變?yōu)門EVO的存活提供了有利條件，促使其與宿主形成長(zhǎng)期共存狀態(tài)。本研究結(jié)果為阿薩希毛孢子菌微進(jìn)化的后續(xù)研究指明了方向，后期深入的分子學(xué)機(jī)制等方面的研究也將為臨床治療提供新思路。