段 林， 何艷艷， 李天曉， 陳 松， 賀迎坤， 吳海剛， 盧韜源

目前腦血管介入技術(shù)已取得重大進(jìn)展，但顱內(nèi)支架應(yīng)用過程中仍存在早期腦卒中風(fēng)險和支架內(nèi)再狹窄問題［1-2］。這可能與支架植入時血管內(nèi)皮受損導(dǎo)致內(nèi)膜下成分暴露， 炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞浸潤，平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖、遷移，血管外基質(zhì)重構(gòu)以及炎性反應(yīng)有關(guān)［3-4］。支架植入后可發(fā)生再內(nèi)皮化，防止支架與血流接觸，促進(jìn)活性因子的釋放，從而抑制血栓形成和炎癥，降低支架內(nèi)再狹窄［5］。 許多學(xué)者將其視為改善支架性能的潛在突破點。Wu 等［6］將不同程度上調(diào)和下調(diào)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞支架分別置入兔腹主動脈，1 周后發(fā)現(xiàn)VEGF 過表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞支架被完全覆蓋，而VEGF 干擾組兔則延遲至4 周，表明過VEGF表達(dá)可減少新內(nèi)膜增生，促進(jìn)內(nèi)皮化，降低支架內(nèi)再狹窄。 不過該實驗存在細(xì)胞支架儲存、運輸和植入操作不便問題。本實驗利用細(xì)胞胞吞作用，將基質(zhì)膠、黏連蛋白和人VEGF 重組質(zhì)粒作為鎳鈦合金絲涂層液，以便質(zhì)粒主動運輸至細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

人VEGF 重組質(zhì)粒由本中心實驗室原先合成。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購自中國科學(xué)院， 鎳鈦合金絲（d=0.66 mm）由湖南瑞康通科技發(fā)展公司提供。 基質(zhì)膠、 黏連蛋白購自北京索萊寶科技公司，Hoechst熒光染料和4%多聚甲醛購自上海碧云天生物技術(shù)公司， 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液購自武漢普諾賽生命科技公司，胰酶和磷酸緩沖液（PBS）購自美國Thermo Fisher 科技公司。

1.2 鎳鈦合金絲表面處理和涂層制備

將鎳鈦合金絲剪成1 cm 長，分別用丙酮、無水乙醇和去離子水超聲10 min，洗去表面污漬，氮氣吹干后置于4℃冰箱備用。 將分裝的基質(zhì)膠、黏連蛋白和人VEGF 重組質(zhì)粒于4℃冰箱過夜解凍， 在低溫配液恒溫模塊上用預(yù)冷槍頭將涂層液配制成基質(zhì)膠（5 mg/mL）、黏連蛋白（40 μg/mL）、重組質(zhì)粒（50 ng/μL）混合液，置于4℃脫色搖床過夜搖勻。 生物安全柜中，鎳鈦合金絲用PBS 清洗3 遍，浸泡于放置低溫配液恒溫模塊上的涂層液30 min；取出鎳鈦合金絲，放入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，一并置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱1 h；取出鎳鈦合金絲，用PBS 輕輕清洗2 遍，轉(zhuǎn)移至新的24 孔板，等待細(xì)胞接種。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和接種

生物安全柜紫外滅菌30 min； 取凍存細(xì)胞于37℃水浴中快速溶解，離心（1 000 r/min）3 min；棄上清液，加入2 mL 完全培養(yǎng)基重懸；細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入含8 mL 完全培養(yǎng)基的10 cm 培養(yǎng)皿，搖勻，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，次日換液，待細(xì)胞密度達(dá)90%左右行傳代和接種；吸棄舊培養(yǎng)基，PBS 清洗2 遍，加入1 mL 胰酶，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞變圓加入2 mL 完全培養(yǎng)基終止消化， 移入15 mL離心管，1 000 r/min 離心3 min，棄上清液，加入2 mL完全培養(yǎng)基重懸，從中吸取10 μL 懸液于血球計數(shù)板計數(shù)， 以每孔8×104細(xì)胞量接種于上述鎳鈦合金絲，并培養(yǎng)48 h。 其余懸液按比鋪板于10 cm 培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.4 細(xì)胞染色和檢測

48 h 后取出24 孔板， 生物安全柜中吸棄舊培養(yǎng)基，用PBS 清洗2 遍，將全部鎳鈦合金絲轉(zhuǎn)至新的24 孔板中， 滴加多聚甲醛固定液使其淹蓋鎳鈦合金絲表面， 固定15 min， 取出分裝的Hoechst 染料，避光1∶1 000 稀釋，并滴加24 孔板中，淹蓋鎳鈦合金絲表面，15 min 后用錫紙將其包裹， 進(jìn)行正置熒光檢測。

2 結(jié)果

48 h 后， 正置熒光顯微鏡觀測到基質(zhì)膠+黏連蛋白包被的鎳鈦合金絲表面細(xì)胞有藍(lán)色熒光，無綠色熒光；含人VEGF 重組質(zhì)粒包被的鎳鈦合金絲表面細(xì)胞有藍(lán)色熒光和綠色熒光，如圖1 所示。 表明人VEGF 重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)，與預(yù)期結(jié)果一致，為下一步構(gòu)建此類重組質(zhì)粒涂層尊定了基礎(chǔ)。

圖1 正置熒光顯微鏡下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染示意圖

3 討論

隨著介入器材改進(jìn)，以及水凝膠、聚羥基乙酸（PGA）、乙交酯-丙交酯共聚物（PGLA）、纖維和聚四氟乙烯等修飾的彈簧圈，藥物洗脫支架和覆膜支架臨床應(yīng)用，神經(jīng)介入術(shù)治療腦血管疾病效果不斷提高［7-8］。 但目前經(jīng)修飾的材料基本是不可降解材料，植入后仍會發(fā)生炎癥、術(shù)后再內(nèi)皮化延遲、血栓形成和支架內(nèi)再狹窄等［9-11］，其基因分子層面研究與實施仍處于探索階段。

基因治療是將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補償缺陷與異?；蛞鸬募膊。_(dá)到治療目的。 其中也包括轉(zhuǎn)基因等方面技術(shù)應(yīng)用，也就是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)插入患者適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。 基因治療廣義上還可包括從DNA 水平采取的治療某些疾病的措施和新技術(shù)。DNA 這種僅被稱為遺傳信息的物質(zhì)，因其序列可編程性、分子識別性、可重構(gòu)性和可預(yù)測的自組裝性，以驚人的速度被鑒定并作為一種新材料被利用［12-13］。 DNA 本身是一種天然納米尺度材料［14］，其衍生物如DNA-RNA［15］、DNA-金屬雜交體［16］和肽核酸（PNA）［17］可通過編程技術(shù)轉(zhuǎn)換成具有明確取向、間距、立體關(guān)系及與生物分子更優(yōu)相互作用的自組裝材料，這使其在改進(jìn)材料發(fā)展和臨床應(yīng)用中具有里程碑意義［18-19］。 質(zhì)粒是基因工程最常見運載體和細(xì)胞染色體外能自主復(fù)制的一種很小的環(huán)狀DNA 分子， 它的存在與否一般對宿主細(xì)胞生存無決定性作用，是基因治療中的理想媒介。 Zha 等［20］用電轉(zhuǎn)法構(gòu)建一種含VEGF 重組質(zhì)粒的外泌體，并將其與3D 打印的多孔骨支架結(jié)合，體內(nèi)研究表明該支架可有效誘導(dǎo)大量血管化骨再生。同樣Ding 等［21］將編碼基質(zhì)金屬蛋白酶-3 組織抑制因子的質(zhì)粒凍干在金屬-聚合物導(dǎo)體支架內(nèi)表面，動物實驗表明該支架可明顯抑制兔模型靜脈移植的內(nèi)皮增生。

本實驗利用細(xì)胞胞吞作用，將基質(zhì)膠、黏連蛋白和人VEGF 重組質(zhì)粒作為鎳鈦合金絲涂層液進(jìn)行表面修飾，以便質(zhì)粒主動運輸至細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行表達(dá)，正置熒光顯微鏡觀測到人VEGF 重組質(zhì)粒組鎳鈦合金絲表面細(xì)胞含綠色熒光，表明人VEGF 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功， 也為構(gòu)建質(zhì)粒基因涂層尊定了基礎(chǔ)。 本實驗創(chuàng)新之處：基質(zhì)膠在10℃以上會發(fā)生凝固成膠，此特性符合人體溫度；基質(zhì)膠本身有促進(jìn)細(xì)胞生長的作用，對人體無細(xì)胞毒性；質(zhì)粒通過主動轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞， 動物實驗時不需其他輔助手段。但也存在不足之處，僅靠質(zhì)粒主動轉(zhuǎn)運作用效率較低，涂層粘附性欠缺，對于是否達(dá)到治療的理想狀態(tài)，還需進(jìn)一步驗證涂層的生物學(xué)特性以及后期動物實驗?zāi)Ｐ万炞C。