張戰(zhàn)強(qiáng) 張改玲 蘇云超 何九江 張 敏 楊君芳 張 弦

（北京陸道培醫(yī)院血液科，北京，102600）

急性B 淋巴細(xì)胞白血病是由于前體B 細(xì)胞發(fā)生惡變、無限增殖而產(chǎn)生的疾病。其存在兩個(gè)發(fā)病高峰，一個(gè)是幼年發(fā)病，一個(gè)是成年發(fā)病。幼年發(fā)病的急性B 淋巴細(xì)胞白血病預(yù)后較好，十歲以下兒童單純化療可達(dá)80%以上的治愈率，但仍有少部分患兒會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或難治。而成人急性淋巴細(xì)胞白血病多為標(biāo)危和高危患者，治療效果差，多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)難治和復(fù)發(fā)。難治或復(fù)發(fā)急性B 淋巴細(xì)胞白血?。≧/R B-ALL）對(duì)化療反應(yīng)差，隨著嵌合抗原受體T 細(xì)胞（CAR-T）治療技術(shù)的發(fā)展，CD19-嵌合型抗原受體T 細(xì)胞（CD19-CAR-T）可使R/R B-ALL 的完全緩解率達(dá)到70%～90%。在CAR-T 細(xì)胞治療B-ALL 過程中，需要監(jiān)測CAR-T 細(xì)胞比例和白血病微小殘留病變（MRD）以明確CAR-T 治療的效果。外周血細(xì)胞數(shù)值反映正常造血的狀態(tài)，與骨髓白血病負(fù)荷相關(guān)，有可能反映CAR-T 細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的治療效果。另外，與化療不同，CAR-T 細(xì)胞不殺傷正常造血細(xì)胞，因而CAR-T 細(xì)胞治療后正常造血的恢復(fù)可能快于化療后的造血恢復(fù)。為研究上述兩個(gè)問題，本文比較了CAR-T 治療有效組與CAR-T 治療無效組的外周血細(xì)胞數(shù)值，研究血細(xì)胞數(shù)值對(duì)CART 治療效果的預(yù)測作用，進(jìn)而探討CAR-T 治療對(duì)正常造血的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2017 年5 月～2020 年5 月北京陸道培醫(yī)院應(yīng)用CD19-CAR-T 治療難治/復(fù)發(fā)急性B 淋巴細(xì)胞白血病患者的臨床資料，比較治療后46 例微小殘留病陰性患者和38例微小殘留病陽性患者治療過程中的外周血細(xì)胞參數(shù)。MRD陽性組為CD19-CAR-T 治療細(xì)胞治療后第28 天骨髓檢查微小殘留病為陽性的患者。MRD 陰性組為隨機(jī)選擇的同期進(jìn)行CD19-CAR-T 細(xì)胞治療后第28 天骨髓檢查微小殘留病為陰性的患者。本研究為回顧性分析，符合2013 年修訂的《赫爾辛基宣言》要求。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均進(jìn)行骨髓穿刺行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞表型、細(xì)胞遺傳學(xué)、融合基因和基因突變等檢查，均符合急性B 淋巴細(xì)胞白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②均為難治/復(fù)發(fā)B-ALL，其中復(fù)發(fā)B-ALL 指完全緩解后復(fù)發(fā)，再化療至少1 個(gè)療程不能獲得完全緩解，包括MRD、異基因造血干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)B-ALL，難治B-ALL 指初治B-ALL 患者至少兩個(gè)療程化療未達(dá)到完全緩解；③所有患者ECOG 評(píng)分0～3 分。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①總膽紅素＞170 umol/L；②谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）＞200 umol/L；③血清肌酐清除率小于60 mL/min；④接受異基因造血干細(xì)胞移植后的急性B-淋巴細(xì)胞白血病患者患有急性移植物抗宿主病（aGVHD）≥2 級(jí)或者正在抗aGVHD 治療，如環(huán)孢菌素-B、他克莫司、激素等；⑤CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸前6 周內(nèi)接受過異體細(xì)胞治療，如供體淋巴細(xì)胞回輸、臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞治療；⑥受試者接受最近一次抗腫瘤治療（放化療、單抗或激素）小于1 周；⑦嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血?。X脊液中有腫瘤細(xì)胞，但＜15WBCs/mL 可以入組）；⑧顱內(nèi)高壓或意識(shí)不清；⑨呼吸衰竭；⑩彌漫性血管性內(nèi)凝血；?紐約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA）分級(jí)為Ⅲ級(jí)以上者。

1.3 方法

（1）首先采集患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），進(jìn)行轉(zhuǎn)染等處理產(chǎn)生CD19-CAR-T 細(xì)胞，體外培養(yǎng)11～14d 后回輸。（2）回輸前3～5 d 給予氟達(dá)拉濱/環(huán)磷酰胺方案預(yù)處理，具體用法：氟達(dá)拉濱30 mg/m，d1-3，環(huán)磷酰胺250 mg/m，d1-3。（3）CD19-CAR-T 細(xì) 胞 回 輸 數(shù) 量（1～6）×10/kg。（4）回輸后監(jiān)測病情變化，及時(shí)處理細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）及CAR-T 細(xì)胞相關(guān)腦病綜合征。當(dāng)患者出現(xiàn)發(fā)熱、低血壓、低血氧和臟器毒性反應(yīng)時(shí)，需考慮細(xì)胞因子釋放綜合征的診斷。細(xì)胞因子釋放綜合征的分級(jí)根據(jù)Lee 等對(duì)免疫反應(yīng)所致CRS相關(guān)不良反應(yīng)的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定。對(duì)于輕癥患者可給予吸氧、補(bǔ)液、退熱等對(duì)癥處理，對(duì)于嚴(yán)重患者需及時(shí)給予抗白介素-6 抗體（托珠單抗）和激素治療，必要時(shí)使用呼吸機(jī)等生命支持，以防止出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。CAR-T 細(xì)胞相關(guān)腦病綜合征的診斷從評(píng)估患者的神經(jīng)功能、有無顱內(nèi)壓增高、有無癲癇發(fā)作或肢體無力三個(gè)方面開始，根據(jù)美國CAR-T 細(xì)胞治療相關(guān)毒性（CAR-T-cell-therapy-associatedTOXicity，CARTOX）工作小組提出的針對(duì)CRES 的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將CRES分為1～4 級(jí)。通過CARTOX-10 評(píng)分（總分10 分，10 分為認(rèn)知功能正常者）對(duì)患者的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)估，具體包括詢問患者年、月、城市、所在醫(yī)院名稱和國家領(lǐng)導(dǎo)人姓名（共5 分），命名三個(gè)對(duì)象：如時(shí)鐘、筆和按鈕（最多3 分）；寫一個(gè)完整的句子，如“我的名字是XXX”（1 分）；從100 開始以10 為間隔倒數(shù)計(jì)數(shù)（1 分）。當(dāng)出現(xiàn)嚴(yán)重CRES 反應(yīng)時(shí)，需要給予地塞米松10 mg，4 次/d，必要時(shí)給予鞘內(nèi)注射激素。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）所有患者在CAR-T 細(xì)胞回輸當(dāng)天行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查及MRD 檢測，然后回輸CAR-T 細(xì)胞，所測數(shù)值定義為CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸前的骨髓原始細(xì)胞數(shù)及CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸前的MRD。（2）收集CAR-T 細(xì)胞回輸當(dāng)天，CAR-T 細(xì)胞回輸后第7 天，第14 天，第21 天和第28 天的血常規(guī)、CART 細(xì)胞比例及細(xì)胞因子水平。（3）收集CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸后第28 天的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)及MRD 等療效指標(biāo)。血常規(guī)檢測項(xiàng)目包括白細(xì)胞數(shù)值、血紅蛋白數(shù)值、血小板數(shù)值、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、單核細(xì)胞絕對(duì)值、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比和單核細(xì)胞百分比。（4）療效標(biāo)準(zhǔn)：CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸后第28 天的骨髓細(xì)胞MRD 小于10為CAR-T 治療有效組，不滿足上述標(biāo)準(zhǔn)為CAR-T 治療無效組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的病例特點(diǎn)

兩組患者在性別、年齡方面對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CD19-CAR-T 治療有效組骨髓原始細(xì)胞數(shù)和MRD 平均值遠(yuǎn)低于CD19-CAR-T 治療無效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組的CD19-CAR-T 細(xì)胞峰值和CRS 發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 兩組患者的血常規(guī)

CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸當(dāng)天外周血細(xì)胞數(shù)值：CD19-CAR-T 有效組（MRD 陰性組）的白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白數(shù)值、血小板數(shù)值及中性粒細(xì)胞數(shù)值明顯高于CD19-CAR-T 無效組（MRD 陽性組）的數(shù)值，兩者對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其他血細(xì)胞數(shù)值兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸?shù)? 天外周血細(xì)胞數(shù)值：CD19-CAR-T 有效組的平均血小板數(shù)值為91.46×10/L，明顯高于CD19-CAR-T 無效組的平均血小板數(shù)值61.89×10/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其他外周血細(xì)胞數(shù)值兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸?shù)?4 天外周血細(xì)胞數(shù)值：CD19-CAR-T 有效組的平均血小板數(shù)值為135.92×10/L，明顯高于CD19-CAR-T 無效組的平均血小板數(shù)值63.85×10/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其他外周血細(xì)胞數(shù)值兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸?shù)?1 天外周血細(xì)胞數(shù)值：CD19-CAR-T 有效組的平均血小板數(shù)值為89.56×10/L，明顯高于CD19-CAR-T 無效組的平均血小板數(shù)值40.54×10/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其他外周血細(xì)胞數(shù)值兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸?shù)?8 天外周血細(xì)胞數(shù)值：兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

對(duì)白血病的免疫治療，人類探索了100 多年，但療效并不確切。正是由于嵌合型抗原受體T 細(xì)胞的出現(xiàn)才使免疫治療從幕后走向了前臺(tái)，顯示出了確切的療效。正常的T 細(xì)胞依靠表面的T 細(xì)胞受體識(shí)別腫瘤細(xì)胞，識(shí)別的方式是T 細(xì)胞受體識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面由主要組織相容性遞呈的腫瘤抗原。但腫瘤細(xì)胞經(jīng)常通過喪失主要組織相容性抗原，或者不遞呈腫瘤抗原而防止被T 淋巴細(xì)胞受體識(shí)別和殺傷，進(jìn)而達(dá)到免疫逃逸的目的。與T 細(xì)胞不同，B 細(xì)胞是通過表面的受體直接識(shí)別腫瘤表面標(biāo)志，而無需主要組織相容性抗原的輔助，其識(shí)別抗原主要是抗體的可變區(qū)，正是基于這種思想，美國國立衛(wèi)生研究院的Rosenberg 等首次通過病毒將識(shí)別抗原的抗體單鏈可變區(qū)基因?qū)氲絋 細(xì)胞，使其在T 細(xì)胞表面表達(dá)，而直接識(shí)別腫瘤表面的標(biāo)志，稱之為嵌合型抗原受體T 細(xì)胞，隨后利用針對(duì)B 細(xì)胞表面標(biāo)志CD19 的嵌合型抗原受體T（CD-19-CAR-T）細(xì)胞在復(fù)發(fā)難治的急性B 淋巴細(xì)胞白血病檢測中取得了巨大成功。

急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)難治的原因多為篩選出了復(fù)發(fā)難治的克隆，此克隆經(jīng)常表現(xiàn)為多藥耐藥，導(dǎo)致挽救治療完全緩解率很低，尤其是達(dá)到MRD 陰性的完全緩解率更低。復(fù)發(fā)難治的急性淋巴細(xì)胞白血病再次緩解后，只有進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植才能徹底治愈。而移植的成功率主要取決于是否達(dá)到完全緩解，尤其是MRD 陰性完全緩解。MRD 陰性的移植成功率明顯高于MRD 陽性的患者。

CD19-CAR-T 細(xì)胞使難治復(fù)發(fā)急性B 淋巴細(xì)胞白血病達(dá)到MRD 陰性完全緩解方面具有明顯的優(yōu)勢。因此，采用CD19-CAR-T 細(xì)胞治療復(fù)發(fā)難治的急性B 淋巴細(xì)胞白血病達(dá)MRD 陰性后再行異基因干細(xì)胞移植，可使更多患者獲得治愈的機(jī)會(huì)。CD19-CAR-T 細(xì)胞的療效取決于CD19-CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)增程度，以及CD19-CAR-T 細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的比例。所以需要監(jiān)測CAR-T 細(xì)胞比例及白血病微小殘留病變（MRD）以明確CAR-T 細(xì)胞治療的效果，但需要流式細(xì)胞儀等設(shè)備，監(jiān)測成本高且耗時(shí)。尋找可替代的方法可以促進(jìn)CAR-T 細(xì)胞治療技術(shù)的應(yīng)用及降低費(fèi)用。外周血細(xì)胞數(shù)值變化反映正常骨髓造血，而且有助于了解白血病細(xì)胞對(duì)正常造血的影響，有可能預(yù)示CD19-CAR-T 細(xì)胞的治療效果，為此進(jìn)行了該項(xiàng)研究。

在CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸當(dāng)天，CD19-CAR-T 有效組患者白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板和中性粒細(xì)胞數(shù)明顯高于CAR-T 有效組的數(shù)值，說明CAR-T 有效組初始腫瘤負(fù)荷低，對(duì)正常造血的抑制作用弱，這也與兩組治療前CAR-T 有效組CAR-T 前骨髓原始細(xì)胞數(shù)和MRD 低于CAR-T 無效組相一致，提示CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸當(dāng)天骨髓抑制輕者易于達(dá)到MRD 陰性，因而CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸當(dāng)天外周血細(xì)胞數(shù)值有可能做為CAR-T 細(xì)胞治療效果的預(yù)測指標(biāo)。

本研究中CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸后第7 天、第14 天和第21 天的平均血小板數(shù)值，在CD19-CAR-T 有效組明顯高于CD19-CAR-T 無效組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示在CD19-CAR-T 有效組患者中，CD19-CART 細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞清除速度快，正常造血功能恢復(fù)快速，表現(xiàn)為外周血小板數(shù)值的快速升高。因而CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸后第7天、第14 天和第21 天血小板數(shù)值有可能做為CAR-T 細(xì)胞治療效果的預(yù)測指標(biāo)。

急性淋巴細(xì)胞白血病化療后血小板數(shù)值的上升，尤其是血小板的上升速度，反映了正常骨髓造血的恢復(fù)。而化療后正常骨髓造血的恢復(fù)除取決于殘留白血病細(xì)胞的抑制程度，還取決于化療的抑制程度。所以血小板的恢復(fù)反映骨髓原始細(xì)胞的下降程度，與MRD 相一致，而且也與化療的抑制程度相一致。研究顯示血小板數(shù)值的恢復(fù)多在化療后14～28 d。

本研究中CD19-CART 細(xì)胞治療后第7 天，治療有效組血小板即明顯高于治療無效組，明顯早于化療后14～28 d 血小板恢復(fù)的時(shí)間，提示CAR-T 細(xì)胞后的造血恢復(fù)早于化療后的造血恢復(fù)。其原因可能在于化療對(duì)白血病細(xì)胞和正常造血細(xì)胞均進(jìn)行殺傷，與之不同，CD19-CAR-T 細(xì)胞治療急性淋巴細(xì)胞白血病時(shí)，僅針對(duì)白血病細(xì)胞進(jìn)行殺傷，正常造血細(xì)胞不受傷害，正常造血的恢復(fù)主要取決于骨髓中白血病細(xì)胞數(shù)量，所以恢復(fù)速度較快，表現(xiàn)為血小板的快速上升。

綜上所述，外周血細(xì)胞參數(shù)對(duì)CD19-CAR-T 細(xì)胞的治療效果具有預(yù)測作用。CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸當(dāng)天白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板和中性粒細(xì)胞數(shù)值高者，CD19-CAR-T 細(xì)胞回輸后第7 天、第14 天和第21 天血小板數(shù)值高者預(yù)示CART 細(xì)胞治療效果好，因而血常規(guī)的變化可以用來預(yù)測CD19-CAR-T 細(xì)胞的療效，同時(shí)提示CAR-T 細(xì)胞治療后較化療后正常造血恢復(fù)速度快。