王晶，王宏浩，向田，任文鎮(zhèn)，劉杲（.武漢市漢口醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 005；.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部恩施臨床學(xué)院暨恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 胃腸外科 湖北 恩施 5000；.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 臨床檢驗中心，湖北 恩施 5000；.湖北醫(yī)藥學(xué)院恩施培養(yǎng)基地胃腸外科，湖北 恩施 5000）

胃癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，2021年流行病學(xué)統(tǒng)計結(jié)果[1]顯示，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率在所有腫瘤中位于第四位，但病死率高居第三。盡管目前胃癌的診治技術(shù)有了較大的進(jìn)步，但由于其早期缺乏特異癥狀、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，多數(shù)患者就診時已是中晚期。術(shù)后化療作為進(jìn)展期胃癌患者的主要治療手段的，部分患者易出現(xiàn)多種不良反應(yīng)難以耐受，且治療過程中易出現(xiàn)對化療藥物的耐藥[2]，故患者5年生存率仍相對較低[3]。多聚ADP核糖聚合酶1（poly-ADPribose polymerase 1，PARP1）為一種廣泛存在于多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白核酶，其介導(dǎo)的N-糖基化修飾與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，a-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8（a-1，6-fucosyltransferase 8，F(xiàn)UT8）是其中的關(guān)鍵酶。ADP-核糖基化的最新進(jìn)展為人類腫瘤治療提供了新的方向[4-5]。外源性給予PARP1抑制劑能夠顯著抑制肺腺癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)，增加肺癌細(xì)胞對藥物的敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[6-7]。在卵巢癌[8]、乳腺癌[9]及宮頸癌[10]等多種腫瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)，沉默PARP1基因可顯著增強(qiáng)放療敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但其在胃癌中作用的研究尚少。本研究通過對胃癌患者組織和細(xì)胞中PARP1的研究，并結(jié)合生物信息學(xué)方法探究其對胃癌AGS細(xì)胞增殖和耐藥性的影響及潛在機(jī)制，這對發(fā)現(xiàn)新的治療靶點、改善患者預(yù)后等都具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人胃癌細(xì)胞AGS和SGC-7901購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，均采用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，PARP1抑制劑AG14361購自美國Sigma-Aldrich公司（用5 μL 4.74%的DMSO溶解后用于細(xì)胞實驗），DNA Ligation Kit試劑盒購自日本TOYOBO公司，TRIzol和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，RIPA裂解液，BCA蛋白定量試劑盒，MTT、CCK-8試劑盒和AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天公司，一抗[兔抗 PARP1（ab191217）、FUT8（ab191571）、β-actin（ab179467）單克隆抗體]和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（ab6721）均購自英國Abcam公司，ECL顯色液和PVDF膜購自美國Millipore公司。IX83倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司，Agilent 2100 Bioanalyzer生物芯片分析系統(tǒng)購自美國AgilentTechnologies公司，ABI7500型qPCR儀購自美國ABI公司，F(xiàn)ACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，RT-6100全自動酶標(biāo)分析儀購自深圳雷杜公司，GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 臨床樣本

收集2018年5月至2019年12月間經(jīng)恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院病理科醫(yī)生明確診斷為胃癌的石蠟組織切片72例（其中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶組織37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶組織35例），同時收集相應(yīng)距腫瘤邊緣5 cm以上的癌旁組織標(biāo)本切片。入選患者包括男性43例、女性29例，中位年齡52（38～80）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本采集前患者未接受過術(shù)前的放療或化療治療，無其他腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他胃部疾病的患者，不同意樣本采集的患者，信息不全的患者。所有患者術(shù)前均告知研究過程并簽署知情同意書，研究方案得到所在醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測PARP1在胃癌組織中的表達(dá)

術(shù)后立即將組織標(biāo)本放入4%多聚甲醛中固定，經(jīng)全自動免疫組織化學(xué)染色儀脫水、石蠟包埋、制成切片等步驟后，加入10 μg/mL的PARP1抗體，然后依次采用生物素化抗小鼠IgG二抗，隨后用堿性磷酸酶鏈霉親和素和顯色原進(jìn)行染色。經(jīng)蘇木精復(fù)染、脫水、透明后用中性樹膠封片，采用倒置顯微鏡觀察，在高倍鏡下觀察樣本，每個視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，每張切片觀察5個視野。結(jié)果判讀：PARP1陽性信號定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性，無棕黃染色者為陰性；染色呈黃色計為1分，染色呈棕黃色計為2分，染色呈棕色計為3分。同時按每高倍鏡視野陽性細(xì)胞百分比計分，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%計為0分，5%～＜26%計為1分，26%～＜50%計為2分，50%～＜75%計為3分，≥75%計為4分。兩種計分的乘積即為陽性強(qiáng)度：＜3分為陰性表達(dá)，≥3分為陽性表達(dá)（最高分為12分）。

1.4 MTT法檢測AG14361殺傷AGS細(xì)胞的IC50

將AGS細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，經(jīng)0.25%胰酶消化、洗滌、計數(shù)，重懸于10%FBS的DMDM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個/mL，按100 μL/孔接種至96孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，分別加入不同濃度的AG14361，AG14361的終濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3和1.5 μmol/L，同時設(shè)陰性對照（加入等體積的DMSO），各組設(shè)3個復(fù)孔。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT（5 mg/mL），10 μL/孔，待培養(yǎng)結(jié)束，用全自動酶標(biāo)儀檢測各孔光密度（D）值，波長為490 nm。根據(jù)檢測結(jié)果計算AG14361對AGS細(xì)胞的IC50（50%細(xì)胞生長抑制所需的藥物濃度），抑制率=（對照組D值-實驗組D值）/對照組D值×100%。

1.5 qPCR法檢測AG14361對AGS細(xì)胞中PARP1和FUT8表達(dá)的影響

收集處于對數(shù)生長期細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用10 μL體系，包括1 μLcDNA、5 μL2×SYBGREEN Mix、1 μL上下游引物混合液（引物混合物濃度為2 μmol/L）、3 μL無RNA酶的水，設(shè)置3個復(fù)孔。引物由武漢擎科生物合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為95℃10 min；95℃15 s、60 ℃30 s、72℃1 min，共40個循環(huán)。β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)量。

表1 qPCR引物序列

1.6 WB法檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

采用RIPA裂解液將收集的細(xì)胞在冰上進(jìn)行裂解，BCA蛋白定量法測定蛋白質(zhì)濃度，隨后加入1 mL 5×SDS上樣緩沖液混勻，100℃干浴5 min。每樣本取15 μg蛋白質(zhì)行SDS-PAGE，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗4℃過夜，1×TBS/T輕洗3遍，加入二抗，室溫處理1 h，1×TBS/T輕洗3遍，加入ECL發(fā)光劑進(jìn)行顯色及凝膠成像儀顯影，采用Image J2x軟件分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算靶蛋白的相對表達(dá)。

1.7 CCK-8法檢測AG14361對胃癌細(xì)胞增殖的影響

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，按1×103個/孔均勻接種于96孔板，加入AG14361使藥物濃度達(dá)IC50，每孔總體積為100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱23 h，然后每孔加入10 μL CCK-8培養(yǎng)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處D值，D值反映細(xì)胞增殖狀況。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測AG14361對胃癌細(xì)胞凋亡的影響

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按1×105個/孔均勻接種于6孔板中，然后加入AG14361使藥物濃度為IC50，每孔總體積為4 mL，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄上清，1×PBS輕洗3遍，胰酶消化，800×g離心5 min，棄上清，加入195 μLAnnexinⅤ-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞；隨后依次加入5 μLAnnexin Ⅴ-FITC和10 μL碘化丙啶染色液混勻后室溫避光放置20 min，隨后置于冰浴中。采用FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

1.9 細(xì)胞集落形成實驗檢測AG14361對胃癌細(xì)胞克隆形成的影響

取對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞，進(jìn)行胰酶消化，制成1×103個/mL的細(xì)胞懸液。取1 mL接種于12孔板，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻，37℃、5% CO2中培養(yǎng)2周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)，PBS輕洗3次，空氣干燥。4%多聚甲醛/甲醇固定15 min，棄甲醇后空氣干燥。用0.5%結(jié)晶紫溶液染色20 min，PBS洗3次，晾干。在顯微鏡下以肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)作為計數(shù)細(xì)胞集落的標(biāo)準(zhǔn)，拍照并使用Image J2x軟件進(jìn)行計數(shù)。

1.10 AGS細(xì)胞基因測序及差異基因富集分析

AGS細(xì)胞分別使用DMSO和IC50濃度的AG14361處理24 h后提取總RNA，送北京奧維森科技進(jìn)行mRNA測序，每組3個生物學(xué)重復(fù)。樣品總RNA經(jīng)定量、完整性檢測后進(jìn)行測序分析。FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped reads）是目前最為常用的基因表達(dá)水平估算方法，以FPKM＞1界定基因表達(dá)，用火山圖可以展示差異基因的整體分布情況。鑒定差異基因后對差異基因進(jìn)行功能富集分析。用H-cluster方法對差異基因的相對表達(dá)水平值log2（FPKM）進(jìn)行聚類，做層次聚類分析。差異表達(dá)基因KEGG富集分析結(jié)果通過散點圖進(jìn)行圖形化展示。Rich factor、-log10（Pvalue）和富集到此通路上的基因個數(shù)來衡量KEGG富集程度。Rich factor指pathway中富集到的差異表達(dá)基因數(shù)量與注釋基因數(shù)量的比值。

1.11 向AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染FUT8 siRNA以干擾FUT8 mRNA的表達(dá)

siFUT8和siNCRNA由上海英俊公司合成，序列如下 ：siFUT8，5'-GGACUGCACAAUCGAUACATT-3'；siNC： 5'-GGTTCAACGTTCTTCAGTCAGATCT-3'。siFUT8的轉(zhuǎn)染完全按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。AGS細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種6孔板，37℃培養(yǎng)過夜，更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基。將2.2 pmol的siFUT8 RNA溶于無血清培養(yǎng)基中，顛倒混勻后，加入8 μL的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)染無干擾作用的siNC作為陰性對照。37℃下培養(yǎng)72 h后檢測FUT8 mRNA水平，評估轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞干擾FUT8表達(dá)效果。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，兩組以上數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析；兩組間率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中PARP1表達(dá)水平

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析PARP1在胃癌及正常胃組織中表達(dá)差異，結(jié)果（圖1A）顯示，胃癌組織中PARP1基因表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P＜0.001）。對72對胃癌組織和癌旁組織中PARP1基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，qPCR檢測結(jié)果（圖1B）顯示，癌組織標(biāo)本中PARP1基因表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（t=20.91，P＜0.001）；免疫組化檢測結(jié)果（圖1C）顯示，胃癌組織中PARP1陽性表達(dá)率顯著高于相應(yīng)癌旁組織（P=＜0.001，表2）。

表2 PARP1在胃癌及癌旁組織中表達(dá)陽性率狀況

2.2 AG14361可抑制胃癌細(xì)胞增殖而促進(jìn)細(xì)胞凋亡

MTT法檢測結(jié)果（圖2A）顯示，作為PAPP1抑制劑，AG14361殺傷AGS細(xì)胞的IC50為17.31 μmol/L。使用IC50的AG14361處理AGS細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與空白對照相比，細(xì)胞增殖水平顯著減低（P＜0.001，圖2B），平板集落形成試驗也顯示AG14361可顯著抑制細(xì)胞集落的形成（P＜0.001，圖2C、D），細(xì)胞凋亡水平顯著增加（P＜0.001，圖2E、F），凋亡蛋白BAX表達(dá)顯著增加、抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)顯著降低（圖2G）。

2.3 AG14361可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對5-FU的化療敏感性

MTT法檢測結(jié)果顯示，5-FU殺傷AGS和SGC-7901 細(xì)胞的IC50分別為 5.124 μg/mL 和 1.070 μg/mL（圖3A、B）。在用17.31 μmol/L的AG14361處理細(xì)胞后再以5-FU殺傷AGS和SGC-7901細(xì)胞，IC50分別降為2.009 0 μg/mL和0.586 7 μg/mL（圖3C、D）。與單獨(dú)5-FU處理相比較，在經(jīng)AG14361處理后5-FU再處理，其殺傷AGS細(xì)胞的IC50下降了60.79%、殺傷SGC-7901細(xì)胞的IC50下降了41.74%，說明AG14361可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對化療藥物5-FU的敏感性。

2.4 AG14361促進(jìn)AGS細(xì)胞N-糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8的表達(dá)

AG14361處理AGS細(xì)胞24 h后提取總RNA，進(jìn)行mRNA測序。以FPKM＞1界定基因表達(dá)，共計檢測到40 305個基因。將差異基因篩選閾值界定為|Log2（FoldChang）|＞1且qvalue＜0.005，共篩選到5 496個基因，其中上調(diào)基因2 972個、下調(diào)基因2 524個（圖4A）。差異表達(dá)基因KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，共有10條腫瘤及胃功能相關(guān)信號軸被富集且表達(dá)水平具有顯著差異，這些信號軸涉及細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、基因同源重組、P53信號軸和核酸剪接修復(fù)等，尤其是在N-糖基化修飾方面也顯示出重要作用（圖4B）。采用KEGG基因聚類進(jìn)一步分析，熱圖結(jié)果（圖4C）顯示，AG14361可顯著促進(jìn)N-糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8等基因的表達(dá)。為驗證AG14361對FUT8的調(diào)控作用，分別使用qPCR和WB檢測AGS細(xì)胞經(jīng)AG14361處理后細(xì)胞中FUT8的表達(dá)量，結(jié)果顯示，AG14361處理AGS細(xì)胞后，細(xì)胞中FUT8基因（P＜0.05，圖4D）和蛋白（圖4E）的表達(dá)水平都有所升高。

2.5 PARP1通過調(diào)控N-糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8促進(jìn)AGS細(xì)胞增殖

為進(jìn)一步探究FUT8對胃癌細(xì)胞的影響，對AGS細(xì)胞進(jìn)行siFUT8干擾處理（見圖5A、B），同時使用17.31 μmol/L的AG14361分別處理siNC和siFUT8組的AGS細(xì)胞，CCK-8法檢測結(jié)果（圖5C）顯示，與siNC組相比，siFUT8組AGS細(xì)胞的增殖水平顯著升高（P＜0.01），而 AG14361處理可顯著逆轉(zhuǎn)該影響（P＜0.001）；平板集落形成實驗結(jié)果（圖5D、E）顯示，siFUT8組AGS細(xì)胞集落的形成能力較siNC組顯著增強(qiáng)（P＜0.001），而AG14361處理可顯著抑制該影響（P＜0.01）；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果（圖5F、G）也顯示，AG14361可顯著逆轉(zhuǎn)siFUT8所致AGS細(xì)胞增殖的增加，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡（均P＜0.01），同時促進(jìn)凋亡蛋白BAX表達(dá)、抑制抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)（圖5H）。

3 討 論

由于絕大多數(shù)胃癌患者在確診時已進(jìn)入進(jìn)展期或晚期，因此術(shù)后藥物治療便成為胃癌治療的主要手段[11]。其中化療藥物如氟尿嘧啶類、紫杉醇類、表柔比星類及鉑類藥物在胃癌的藥物治療中使用最為廣泛，它們多是通過損傷腫瘤細(xì)胞核酸功能而發(fā)揮抗癌作用的[12]。但隨著患者用藥時間的延長，腫瘤細(xì)胞DNA的損傷可以通過激活機(jī)體DNA損傷應(yīng)答機(jī)制得以修復(fù)，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，而腫瘤細(xì)胞耐藥的出現(xiàn)便成為影響患者生存時間和生存質(zhì)量中最亟待解決的問題[13]。因此，在DNA損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用的PARP1便成為腫瘤治療及耐藥研究的焦點分子而備受關(guān)注。

PARP1在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，通過siRNA技術(shù)干擾PARP1基因的表達(dá)能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞復(fù)制過程中的DNA損傷修復(fù)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA損傷的積聚和自我凋亡的啟動，進(jìn)而到達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果[14-15]。本研究首先通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析比較胃癌組織與正常組織中PARP1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PARP1在胃癌組織中表達(dá)顯著升高。對收集的胃癌患者組織與癌旁組織進(jìn)行qPCR和免疫組化分析，同樣發(fā)現(xiàn)PARP1在胃癌組織中呈高表達(dá)。王睿等[16]通過ELISA法檢測胃癌患者血清中PARP1含量時發(fā)現(xiàn)，患者血清中PARP1表達(dá)顯著升高；同時也有研究[17]顯示PARP1可作為胃癌獨(dú)立預(yù)后和疾病診斷和進(jìn)展的重要生物學(xué)標(biāo)志。這都說明胃癌患者PARP1可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

抑制PARP1的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)過程，臨床前及臨床研究[6-9]均已證明，在多種腫瘤中抑制PARP1的表達(dá)均具有增強(qiáng)化療、放療等治療效果的潛力，因此PARP1抑制劑在臨床抑制腫瘤耐藥中也日益受到關(guān)注，被認(rèn)為是一種很有前景的抗癌策略。奧拉帕利、盧卡帕利、尼拉帕利和他拉唑帕利等4種PARP 1/2抑制劑已獲得美國FDA批準(zhǔn)，其在治療與人類乳腺癌易感基因1和2（breast cancer susceptibility gene1/2，BRCA1/2）突變所致的卵巢癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、晚期前列腺癌和胰腺癌等腫瘤的治療中均取得了較好的療效[18]。同時一些PARP1抑制劑（如BMN673、AG14361、NMS-P118和BYK204165等）正逐步進(jìn)入臨床評估[19-20]。AG14361是一種有效的PARP1抑制劑，它可通過誘導(dǎo)caspase 3/7的活化而調(diào)控細(xì)胞周期異常，并抑制NF-κB信號激活[21]。WANG等[22]使用AG14361處理胃癌細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，AG14361可增強(qiáng)順鉑耐藥的胃癌細(xì)胞的化療敏感性。而5-FU作為胃癌化療過程中最常見的化療藥物之一，AG14361對其化療敏感性影響的研究尚少。因此，本研究首先通過對胃癌AGS細(xì)胞使用AG14361抑制劑處理，觀察其對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AGS細(xì)胞細(xì)胞增殖、集落形成能力顯著降低，細(xì)胞凋亡顯著增加。于是使用AG14361聯(lián)合5-FU分別處理AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞系，觀察其對5-FU化療敏感性的影響，結(jié)果顯示其可顯著降低化療藥物5-FU的IC50，這說明AG14361也可顯著增強(qiáng)化療藥物5-FU對胃癌細(xì)胞的敏感性，這也為PARP1抑制劑AG14361聯(lián)合放化療藥物治療胃癌奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。

為探究AG14361抑制胃癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)5-FU敏感性的機(jī)制，通過AG14361處理AGS細(xì)胞后進(jìn)行mRNA測序，進(jìn)一步分析差異基因的變化，并通過信號通路的富集分析發(fā)現(xiàn)，N-糖基化修飾在PARP1介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞增殖中起著重要作用，提示AG14361可通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞糖基化修飾進(jìn)而提高胃癌細(xì)胞對5-FU的敏感性。糖基化修飾是蛋白翻譯后修飾中最重要的加工環(huán)節(jié)之一，尤其是N-糖基化修飾，占到生物體總糖基化修飾的一半以上，其異常修飾常與細(xì)胞癌變、轉(zhuǎn)移、抗原提呈、免疫逃逸等腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)[23]。FUT8屬于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族，是參與N-聚糖核心巖藻糖基化的關(guān)鍵酶[24]。研究結(jié)果[25]顯示，F(xiàn)UT8在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增高，而胃癌癥表達(dá)則顯著降低；臨床研究結(jié)果[26-27]也顯示，胃癌患者FUT8的表達(dá)與胃癌患者生存、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后等多種病理臨床特征密切相關(guān)，即FUT8表達(dá)越高，患者總體生存率越好，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究使用AG14361處理AGS細(xì)胞，通過生物信息這方法進(jìn)行mRNA測序和KEGG基因聚類分析，發(fā)現(xiàn)AG14361處理后N-糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8等基因的表達(dá)顯著升高，并且抑制PARP1表達(dá)后AGS細(xì)胞內(nèi)FUT8顯著升高。

為進(jìn)一步證實PARP1通過調(diào)控胃癌細(xì)胞中FUT8的表達(dá)介導(dǎo)胃癌細(xì)胞的惡行進(jìn)展，對AGS細(xì)胞進(jìn)行FUT8干擾處理，同時使用AG14361處理，觀察胃癌AGS細(xì)胞的增殖、集落形成和凋亡狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AG14361可以顯著逆轉(zhuǎn)AGS細(xì)胞FUT8干擾帶來的胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，這進(jìn)一步說明了PARP1可能通過下調(diào)胃癌細(xì)胞中FUT8的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。當(dāng)然，本研究僅從生物學(xué)行為上初步證實抑制PARP1的表達(dá)可以通過增加FUT8的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的惡性改變，從而達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞增殖的效果，而其中的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究通過以胃癌組織和胃癌細(xì)胞的為研究對象，初步證實了PARP1可通過促進(jìn)N-糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8的表達(dá)介導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡和影響化療藥物敏感性，這為AG14361等PARP1抑制劑轉(zhuǎn)化至臨床治療胃癌等腫瘤提供了實驗依據(jù)。