王琦，樊博，劉彬，馬永良，任宗濤，張愛莉（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院 泌尿外科，河北 石家莊 050011）

據(jù)統(tǒng)計，腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）的發(fā)病率在全世界男性腫瘤發(fā)病率中排名第九，在女性腫瘤發(fā)病率中排名第14位[1]。2018年，全球約有40萬人被診斷為RCC[2],盡管總體發(fā)病率有所增加，但在過去的三十年中，相對存活率有所提高[3]。有報道[4]顯示，早期RCC的5年生存率為93%。由于腎的解剖位置隱蔽，相當一部分RCC患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期，可能出現(xiàn)“腎癌三聯(lián)征”（血尿、腰痛、腹部腫塊），且伴有遠處器官轉移，失去了治療的最佳時機。目前，局限性RCC的治療方法治療包括腎切除術、放射消融、局部栓塞和主動監(jiān)測，而轉移性RCC（metastatic RCC，mRCC）需要手術與全身治療相結合。由于RCC對傳統(tǒng)放化療并不敏感，所以近些年出現(xiàn)了許多針對mRCC的新療法，包括靶向治療和免疫治療[5]。但靶向治療、免疫治療仍有一定局限性，因此迫切需要進一步探索RCC進展的分子機制，并找到更為有效的治療靶點。

整合素 β2（integrin β2，ITGB2）也稱為 CD18，位于人染色體21q22.3，是一種細胞表面穿膜受體，參與細胞與細胞外基質的交互作用，具有內外雙向信號轉導能力[6]。多項研究[7-9]表明，ITGB2在乳腺癌、結腸癌、卵巢癌等多種腫瘤中異常高表達，其高表達可促進腫瘤的侵襲及轉移。但ITGB2在RCC中的表達及惡性生物學行為在國內外文獻中罕有報道，本研究通過檢測ITGB2在RCC組織的表達情況，分析了其相對表達量與臨床各參數(shù)間的關系；同時，用shRNA干擾ACHN細胞中ITGB2的表達，檢測體外環(huán)境中敲低ITGB2對ACHN細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，分析ITGB2在RCC發(fā)生發(fā)展中的作用及特點，為治療RCC尋找潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 組織標本、細胞及主要試劑

選取2016至2020年河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院生物標本庫留存的66例RCC患者的手術標本，所有患者術前均未接受任何治療。每例標本均取RCC原發(fā)病灶組織及距癌組織3 cm處癌旁組織。所有標本的切取和使用經(jīng)河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會批準通過（倫理審批編號：2020086）。所有研究對象均簽署知情同意書?；颊呦嚓P信息采集自臨床病歷，病理資料收集自病理診斷報告。

標本一部分采用福爾馬林固定，常規(guī)蠟塊切片留做免疫組化染色；另一部分新鮮狀態(tài)下放入RNALater?動物組織RNA穩(wěn)定保存液中置于4℃冰箱保存24 h后轉入-80℃低溫冰箱中長期保存，用于后期提取組織RNA。腎上皮細胞293T、RCC細胞786-O、ACHN由河北省腫瘤研究所留存并傳代，均在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

逆轉錄試劑盒購自Roche公司，Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，胎牛血清購自PAN-Biotech公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，ITGB2抗體購自Abcam公司，敲低ITGB2的shRNA由上海吉瑪基因公司設計，MTS試劑購自Promega公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Solarbio公司，細胞周期試劑盒購自聯(lián)科生物公司，免疫組化試劑盒購自中杉金橋公司。

1.2 通過網(wǎng)絡大數(shù)據(jù)庫分析ITGB2在RCC組織中的表達

通過整合公共數(shù)據(jù)庫（GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku.cn/index）中癌癥基因表達的數(shù)據(jù)，以進行生物信息學分析，比較RCC和癌旁組織之間ITGB2的表達情況。

1.3 qPCR法檢測RCC組織和細胞中ITGB2的表達

按照TRIzol試劑說明書，逐步提取RCC組織、癌旁組織、腎上皮細胞293T及腎癌細胞786-O、ACHN的總RNA，然后將總RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH為內參，進行qPCR檢測ITGB2的表達。ITGB2上游引物為5'-CTCCAACCAGTT TCAGACCG-3'，下游引物為5'-CGTCATCAGTGG CAAACACC-3'；內參GAPDH上游引物為5'-AGG TGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，下游引物為5'-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3'。qPCR反應條件：95℃預變性10min；95℃變性15 s、57℃退火15 s、72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，72℃終延伸7 min。每個樣本設3個復孔。根據(jù)每孔熒光信號達到閾值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)記為該組織中ITGB2和GAPDH基因轉錄水平的CT值，采用相對定量法：△CT=CTITGB2-CTGAPDH，△△CT=△CT癌組織-△CT癌旁組織，以N=2-△△CT法計算目的基因的相對表達量，其數(shù)值表示癌組織相對癌旁組織的相對倍數(shù)。

1.4 構建敲低ITGB2的shRNA轉染至ACHN細胞

2條敲低ITGB2的shRNA序列分別命名為shITGB2-1（序列為5'-GCATTGGCTTCGGGTCCT TCG-3'）、shITGB2-2（序列為 5'-GCAGGTGTGACA CTGGCTACA-3'），并以shNC作為對照。選擇生長狀態(tài)良好的ACHN細胞用胰酶消化，將細胞均勻接種于6孔板內。待細胞密度達80%左右時，利用Lipofectamine 2000轉染試劑分別將shITGB2-1、shITGB2-2、shNC轉染至ACHN細胞中，在DMEM培養(yǎng)基中饑餓6 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，共培養(yǎng)48 h。收集轉染后的ACHN細胞，提取總RNA,并逆轉錄為cDNA，應用qPCR法檢測轉染后細胞中ITGB2的表達情況。

1.5 MTS實驗檢測敲低ITGB2對ACHN細胞增殖能力的影響

將上述各組細胞轉染24 h后常規(guī)消化懸浮于培養(yǎng)基中，調整細胞密度后分別接種于96孔板（1.0×103個/孔），每組設置6個復孔。分別于細胞貼壁后的0、24、48、72和96 h在每孔中加入MTS試劑20 μL，培養(yǎng)箱孵育2 h。酶標儀測檢測各組細胞在492 nm波長處的光密度（D）值，代表其增殖水平。

1.6 劃痕愈合實驗檢測敲低ITGB2對ACHN細胞遷移能力的影響

將上述各組細胞轉染24 h后常規(guī)消化懸浮于培養(yǎng)基中，調整細胞密度后分別接種于6孔板（5×105個/孔）。待細胞生長至完全匯合時，用移液槍頭垂直6孔板均勻劃痕，PBS洗去劃落細胞，并加入2 mL無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于劃痕后的0、12、24 h在顯微鏡下觀察各組細胞的劃痕間距，計算細胞遷移率，細胞遷移率=（原始劃痕寬度-實時劃痕寬度）/原始劃痕寬度×100%。

1.7 Transwell實驗檢測敲低ITGB2對ACHN細胞侵襲能力的影響

將上述各組細胞轉染24 h后常規(guī)消化懸浮于培養(yǎng)基中，Transwell小室上層加20 μL基質膠過夜，調整細胞密度后接種于小室內（1.0×105個/孔），加入無血清培養(yǎng)基至上室內補齊至200μL；下室內加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h后取出小室，用棉簽拭去基質膠和上室內細胞，PBS沖洗2次，以4%多聚甲醛固定、0.1%結晶紫染色20 min，顯微鏡下計數(shù)5個隨機視野內的細胞數(shù)，計算平均數(shù)并比較各組間侵襲細胞數(shù)的差異。

1.8 流式細胞術檢測敲低ITGB2對ACHN細胞周期的影響

將上述各組細胞轉染48 h后常規(guī)消化懸浮于離心管中，收集1.0×106個細胞，無水乙醇固定，檢測當天水化，加PI染液500 μL避光處理30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.9 WB法檢測敲低ITGB2對ACHN細胞中相關蛋白質表達的影響

用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，每孔蛋白上樣量為30 μg，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，轉膜90 min，5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（抗ITGB2單抗1∶1 000稀釋，抗β-actin單抗1∶2 000稀釋），4℃搖床過夜。第2天，加入二抗（山羊抗兔多抗1∶15 000稀釋)，ECL增強化學發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光。使用Gel-pro軟件對條帶進行定量分析，目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值即代表目的蛋白的相對表達量。

1.10 免疫組化SP染色法檢測RCC組織中ITGB2蛋白的表達

石蠟標本脫蠟，梯度乙醇脫水各5 min，EDTA（pH 9.0）高壓修復10 min，冷卻至室溫，避光修復，于溫箱內用山羊血清封閉，加入一抗（1∶200），4℃冰箱過夜。第2天，滴加生物素化二抗、辣根過氧化物酶標記的三抗，DAB液顯色，蒸餾水終止反應，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、封片。用顯微鏡觀察染色后的切片，染色為淡黃、棕黃至黃褐色視為陽性細胞。依據(jù)隨機原則選取切片中5個視野（放大倍數(shù)：×400），按以下標準進行評分?？偡?細胞膜染色強度評分×視野中陽性細胞占比評分。其中，細胞膜染色強度以無染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、黃褐色為3分。而視野中陽性細胞占比評分以≤10%為0分、＞10%～30%為1分、＞30%～50%為2分、＞50%為3分。總分0～9分，評分＞2分為陽性表達，≤2分為陰性表達。

1.11 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，非符合正態(tài)分布的計量資料用M(Q)表示，采用Wilcoxon或Kruskal-Wallis秩和檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用四格表χ2檢驗。以上結果均采用雙側檢驗，以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ITGB2在RCC組織及RCC細胞中呈高表達

qPCR法檢測結果顯示，RCC組織中ITGB2 mRNA的相對表達量顯著高于癌旁組織（P＜0.01，圖1A），與GEPIA數(shù)據(jù)庫中的結果相似（圖1B）。另外，ITGB2在2株RCC細胞中相對于正常腎上皮細胞表達量均升高（均P＜0.01，圖1C），且細胞ACHN細胞的ITGB2表達水平較786-O細胞更高，故選取ACHN細胞構建敲低ITGB2的細胞株。

免疫組織化學染色結果顯示，ITGB2在RCC組織中陽性表達，在相應癌旁組織中陰性表達（圖2）。

2.2 ITGB2在RCC組織中的表達及其與臨床參數(shù)之間的關系

不同臨床分期的RCC組織中ITGB2的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但按照性別、年齡、有無吸煙史、有無高血壓、有無糖尿病、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移及病理分化程度進行統(tǒng)計分析，各組RCC組織中ITGB2的表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 ITGB2在RCC組織中的表達與臨床參數(shù)之間的關系（N=66）

2.3shRNA-ITGB2轉染后敲低ACHN細胞中ITGB2基因和蛋白的表達

qPCR法檢測結果（圖3）顯示，ACHN細胞轉染shITGB2-1、shITGB2-2后ITGB2的相對表達量均低于shNC組（均P＜0.01），且shITGB2-1、shITGB2-2轉染組干擾效率相近，均可進行后續(xù)實驗。

WB法檢測結果（圖4）顯示，shITGB2-1組、shITGB2-2組的ACHN細胞中ITGB2蛋白表達明顯低于shNC組[（0.56±0.18）、（1.89±0.33）vs（4.14±0.41），均P＜0.01]，表明敲低ITGB2抑制了ACHN細胞ITGB2的蛋白的表達。

2.4 敲低ITGB2抑制ACHN細胞的增殖能力

MTS實驗結果（圖5）顯示，與shNC組相比，72 h時，敲低ITGB2的細胞的D值均顯著降低（P＜0.05），表明敲低ITGB2抑制了ACHN細胞的增殖能力。

2.5 敲低ITGB2抑制ACHN細胞的遷移能力

劃痕愈合實驗結果（圖6）顯示，與shNC組相比，在24 h時，shITGB2-1組、shITGB2-2組細胞的遷移率均顯著降低[（51.33±1.88）%、（48.02±2.12）%vs（87.24±3.51）%，均P＜0.01]，表明敲低ITGB2抑制了ACHN細胞體外遷移能力。

2.6 敲低ITGB2抑制ACHN細胞的侵襲能力

Transwell實驗結果（圖7）顯示，與shNC組相比，每視野中shITGB2-1組、shITGB2-2組穿過人工基底膜的細胞數(shù)均顯著降低[（110.63±17.38）、（101.89±12.67）vs（389.44±35.03）個，均P＜0.05]，表明敲低ITGB2抑制了ACHN細胞的體外侵襲能力。

2.7 敲低ITGB2對ACHN細胞周期無明顯影響

流式細胞術檢測細胞周期結果（圖8）示，shITGB2轉染組G0期細胞數(shù)與shNC組接近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明敲低ITGB2對ACHN細胞周期無明顯影響。

3 討論

既往研究[10]表明，巨噬細胞介導的炎癥反應是許多心血管疾病的關鍵病理生理過程，ITGB2可通過調節(jié)巨噬細胞的運輸，參與心肌肥厚的發(fā)生，因此ITGB2也被認為是炎癥的調節(jié)因子。約80%的RCC患者存在腎臟炎癥，ITGB2可以將T細胞轉移到腸系膜淋巴結，進而促進慢性腎炎的發(fā)展[11]。慢性炎癥能夠促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要原因是慢性炎癥的刺激能夠導致腫瘤釋放許多直接促進腫瘤自身生長的因子[12]。而微環(huán)境的改變是炎癥發(fā)展到腫瘤的關鍵環(huán)節(jié)，在一個富含炎性細胞的腫瘤微環(huán)境中，失衡的生長因子、激活的黏附分子（如ITGB2等）及胞外基質、促DNA損傷介質增加了細胞失控生長,當細胞長期受到這些失衡的炎癥因素調控后可能會導致腫瘤的發(fā)生[13]。另外，ZHANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ITGB2通過PI3K/AKT/mTOR通路增強癌癥相關成纖維細胞糖酵解活性，從而促進口腔鱗癌細胞增殖。WEI等[15]發(fā)現(xiàn)，急性髓系白血病患者中ITGB2的過表達可導致患者預后不良。在鼻咽癌中，既往研究[16]亦發(fā)現(xiàn)，STC2/ITGB2/FAK/SOX6信號軸可能是鼻咽癌潛在的一個治療靶點。在神經(jīng)膠質瘤中，證實了ITGB2高表達水平的患者有更好的免疫治療反應[17]。以上研究為本實驗打下了良好的理論基礎。

本研究通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)課題組收集的66例RCC組織中ITGB2的表達情況與大數(shù)據(jù)庫中的表達情況一致，從而更好地印證了ITGB2在RCC組織中高表達。在臨床病理資料的統(tǒng)計中，本研究發(fā)現(xiàn)分期較晚、瘤負荷較大的腫瘤ITGB2表達量更高，因此ITGB2有望成為腎癌分期診斷的新的腫瘤分子標志物。與食管癌等組織淋巴結轉移強相關不同[18]，腎癌淋巴結轉移較少見，腎癌診療指南中提出局限性腎癌患者不行淋巴結清掃[19]，只有臨床可見的區(qū)域腫大淋巴結，需要行淋巴結清掃術。MTS實驗、劃痕實驗、Transwell實驗結果表明，ITGB2與腎癌細胞增殖、遷移和侵襲能力相關，癌細胞的惡性生物學行為與其轉移等不良預后緊密相關。流式細胞術檢測顯示，ITGB2對細胞周期的影響差異無明顯統(tǒng)計學意義，可能該基因不參與調節(jié)細胞周期。免疫組化的結果顯示，在RCC組織中ITGB2的表達也明顯高于癌旁組織，且均為細胞膜染色，表明ITGB2為一種細胞膜表面受體，可能參與細胞與細胞外基質之間信號轉導。

綜上，本研究從RNA和蛋白質水平均驗證了ITGB2與RCC的相關性，為尋找RCC治療的特異性靶點提供了新的思路，也為RCC的腫瘤標志物探索提供了理論基礎，但具體機制仍不明確，有待進一步研究。