歐陽蒂君，陳楠，楊潔瑩，陳媛媛，向橦，▲，夏建川（.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腫瘤科，廣東 珠海 59000；.中山大學(xué)腫瘤防治中心實(shí)驗(yàn)研究部，華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，腫瘤醫(yī)學(xué)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東省鼻咽癌診斷與治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 50060）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是起源于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤，有三種病理亞型：角化型鱗癌、非角化型鱗癌和基底樣鱗癌。非角化型NPC是NPC流行地區(qū)主要的病理亞型，且與EBV感染高度相關(guān)[1]。EBV陽性的NPC是一種典型的“熱”腫瘤，其被大量的淋巴細(xì)胞所浸潤(rùn)，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)密度越高，患者的預(yù)后越好[2]。然而，有研究[3-8]發(fā)現(xiàn)，EBV可通過多種方式形成免疫抑制微環(huán)境，幫助NPC細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。腫瘤相關(guān)性中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophil，TAN）是腫瘤免疫微環(huán)境中的重要組成部分，已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌[9-11]、肺癌[12-13]、結(jié)直腸癌[14-15]、肝癌[16-17]、胃癌[18-19]、小腸癌[20]等多種癌癥中發(fā)揮重要作用。但是，有關(guān)TAN在NPC中所產(chǎn)生的作用以及EBV感染與NPC TAN之間的關(guān)系的研究仍存在缺失。本研究探討NPC中EBV感染與TAN的關(guān)系，探討NPC中TAN在免疫微環(huán)境中所起的作用及其與NPC患者預(yù)后和臨床特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞與試劑

人NPC細(xì)胞株HK1、HK1-EBV細(xì)胞均由華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（暨中山大學(xué)腫瘤防治中心）提供。中性粒細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞通過密度梯度離心法從健康志愿者的外周血中分離獲得，具體操作步驟見實(shí)驗(yàn)方法部分。胎牛血清（16140089）、RPMI 1640無血清培養(yǎng)基（C11875500BT）和CTSTMAIM VTM無血清培養(yǎng)基（A3021002）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Q-VD-OPh（1-800-343-7475）購(gòu)自美國(guó)R&D公司，抗人髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）一抗（ab9535）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，抗人CD8一抗（ZA-0508-0.2）、抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒（GK500710）和EBER檢測(cè)試劑盒（原位雜交法）（ISH-7001-50）均購(gòu)自中國(guó)中杉金橋公司，人外周血淋巴細(xì)胞分離液（LTS1077-1）購(gòu)自中國(guó)天津?yàn)蠊?，紅細(xì)胞裂解液（CW0613S）購(gòu)自中國(guó)康為世紀(jì)公司，CD8磁珠（130-045-201）購(gòu)自德國(guó)美天旎公司，流式用抗人CD15抗體（301904）、抗人CD16抗體（360704）、抗人CD8a抗體（300926）、抗人CD182抗體（551125）和Zombie染料（423107）均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，流式用抗人CD69抗體（555530）、抗人PD-1抗體（558694）、抗人CD206抗體（321104）及AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（556547）均購(gòu)自美國(guó)碧迪公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司，人CD3/CD28 T細(xì)胞活化添加劑（10971）購(gòu)自加拿大Stemcell公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人NPC細(xì)胞株HK1，使用含有10%胎牛血清和G418（200 μg/mL，ant-gn-5）的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人NPC細(xì)胞株HK1-EBV，使用含有10%胎牛血清和3 μmol/LQ-VD-OPh的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)中性粒細(xì)胞，使用含有10%胎牛血清和300 U/mL IL-2的CTSTMAIMVTM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CD8+T細(xì)胞，均置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞密度和狀態(tài)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基和傳代。

1.3 臨床病理組織樣本

本研究所使用的NPC石蠟組織切片均由中山大學(xué)腫瘤防治中心提供。用于檢測(cè)NPC組織中CD8+T細(xì)胞和TAN浸潤(rùn)情況及用于分析MPO表達(dá)水平與患者生存預(yù)后關(guān)系的石蠟包埋的NPC組織切片均來自2008年至2012年期間中山大學(xué)腫瘤防治中心收治的118例初治無轉(zhuǎn)移NPC患者。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理檢查確診為NPC；（2）術(shù)前未行放療、化療、靶向治療和免疫治療；（3）臨床資料及手術(shù)標(biāo)本組織保存完整；（4）完成隨訪記錄；（5）EBV編碼的小RNA（EBER）檢測(cè)陽性?；颊吲懦龢?biāo)準(zhǔn)：（1）失訪患者；（2）合并其他系統(tǒng)腫瘤的患者；（3）術(shù)后因并發(fā)癥死亡患者；（4）因其他原因死亡患者。研究方案獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：GZR2021-029），并取得患者的知情同意和簽署知情同意書。

1.4 密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞

取健康人外周血樣本，用PBS稀釋，再將其緩緩倒至人外周血淋巴細(xì)胞分離液的上層，1 200×g離心25 min后吸棄上清液，按照體積比3∶1加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，于冰上搖晃裂解30 min，400×g離心后吸棄上清液，加入PBS重懸細(xì)胞沉淀，400×g離心后吸棄上清液，沉淀即為中性粒細(xì)胞。

1.5 密度梯度離心法分離CD8+T細(xì)胞

取健康人外周血樣本，加入人外周血淋巴細(xì)胞分離液后離心，吸取樣本中間的白膜層，加入PBS離心后吸棄上清液，按照體積比3∶1加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，室溫下反應(yīng)10 min，離心后吸棄上清液，加入PBS清洗細(xì)胞沉淀，離心后吸棄上清液，細(xì)胞沉淀按照磁珠分選說明書的操作步驟用CD8磁珠分選CD8+T細(xì)胞。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NPC組織中的MPO和CD8表達(dá)

將NPC石蠟組織切片經(jīng)烤片、脫蠟、梯度水化，pH9.0的EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)、37℃封閉1 h，加入抗MPO一抗（1∶100）、抗CD8一抗37 ℃處理1 h，加入二抗37 °C處理30 min，經(jīng)顯色、復(fù)染、分化、返藍(lán)、乙醇脫水干燥、封片[21]，觀察NPC組織中MPO和CD8的表達(dá)情況。采用HALO軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行病理評(píng)分，得H-Score（軟件評(píng)分系統(tǒng)根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性染色腫瘤細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)分）。根據(jù)H-score的評(píng)分結(jié)果，用受試者工作特征曲線（ROC）求取其截?cái)嘀?。定義H-score大于等于截?cái)嘀档慕M織切片為高表達(dá)，定義H-score小于截?cái)嘀档慕M織切片為低表達(dá)。

1.7 EBER原位雜交法檢測(cè)NPC細(xì)胞和組織的EBV感染情況

細(xì)胞處理：將鼻咽癌細(xì)胞系HK1細(xì)胞懸液滴在防脫處理過的載玻片上，應(yīng)保證樣品是單層細(xì)胞，室溫干燥30 min，用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞10 min，PBS沖洗2 min×3次，逐級(jí)乙醇脫水（70%乙醇2 min、95%乙醇2 min、100%乙醇2 min），空氣干燥。組織切片處理：石蠟包埋的NPC組織切片經(jīng)烤片和脫蠟，在新鮮100%乙醇中放置5 min后，空氣干燥。將上述處理過后的組織切片和細(xì)胞樣品每個(gè)樣品加入300～400 μL新鮮配制的胃酶工作液，于37℃處理，其中石蠟切片處理30 min、細(xì)胞樣品處理10 min，棄去胃酶工作液后，逐級(jí)乙醇脫水（70%乙醇1 min、95%乙醇1 min、100%乙醇1 min），空氣干燥。混勻探針溶液，在每張切片上加10～20 μL適量的探針，加蓋蓋玻片，置于濕盒中37℃處理2 h；將切片浸入PBS緩沖液中10 min，直到蓋玻片自然脫落，用PBS緩沖液沖洗切片2 min×3次，取出切片，擦干多余的緩沖液。切片上加入適量辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體溶液，37 ℃處理30 min，PBS沖洗1 min×3次，用蒸餾水沖洗切片1 min；擦凈切片邊緣的水分，加入適量配制好的DAB工作液，在顯微鏡下觀察到樣品出現(xiàn)棕色時(shí)，即可用蒸餾水終止顯色。復(fù)染和封片，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀：無棕色染色的為EBV陰性細(xì)胞株，有棕色染色的為EBV陽性細(xì)胞株。

1.8 H-E染色法檢測(cè)NPC組織切片中TAN的核形態(tài)

同免疫組織化學(xué)染色的步驟，將NPC組織切片進(jìn)行烤片、脫蠟、梯度水化、復(fù)染、分化、返藍(lán)處理；伊紅染色1 min，流水沖洗后進(jìn)行乙醇脫水、干燥、封片，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.9 吉姆薩染色法檢測(cè)健康人外周血中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)

取從健康人新鮮外周血中即時(shí)分離出的中性粒細(xì)胞，涂在防脫處理過的載玻片上，應(yīng)保證樣品是單層細(xì)胞，室溫干燥30 min；滴加瑞氏-吉姆薩染液A液于涂片上，染色1 min；再將磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）滴加于A液上，滴加量為A液的2倍，以洗耳球吹出微風(fēng)使液面產(chǎn)生漣漪狀，使兩液充分混合，染色3 min；取蒸餾水以流水沖洗玻片，待玻片干燥后，用中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞的純度、凋亡和極化

HK1、HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液的制備：取2.5×106個(gè)HK1和HK1-EBV細(xì)胞，均勻地鋪在T75的培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，每個(gè)T75瓶中加入20 mL的完全培養(yǎng)基，置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d后，收集上清液，400×g離心5 min，獲取的上清液即作為HK1、HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

從健康人外周血中分離出中性粒細(xì)胞，取1×105個(gè)細(xì)胞，加入提前稀釋好的Zombie染料（1∶1 000），4 ℃避光處理20 min；離心后棄上清液，加入抗人CD15抗體和抗人CD16抗體，混勻；4℃避光處理15 min；離心后棄上清液，每管加入200 μL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞的純度。將分離出的中性粒細(xì)胞用加入了HK1、HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液體積∶完全培養(yǎng)基體積=1∶1），用無血清培養(yǎng)基加完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞作為對(duì)照組，置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48和96 h，第72 h時(shí)補(bǔ)液。取1×105個(gè)經(jīng)處理過的中性粒細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，加入AnnexinⅤ染料和PI染料，混勻，4℃避光處理15 min，立即使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)中性粒細(xì)胞的凋亡情況；取1×105個(gè)經(jīng)處理過的中性粒細(xì)胞離心，加入提前稀釋好的Zombie染料（1∶1 000）重懸細(xì)胞，4℃避光處理20 min；離心后棄上清液，加入抗人CD182抗體和抗人CD206抗體，4℃避光處理15 min，離心后棄上清液，每管加入200 μL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，立即使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)中性粒細(xì)胞的極化標(biāo)志物表達(dá)情況。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T的CD69和PD-1的表達(dá)

從健康人外周血中分離出CD8+T細(xì)胞，將分離得到的CD8+T細(xì)胞用加入了人CD3/CD28 T細(xì)胞活化添加劑（1∶25）的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，24孔板鋪板，每孔加入5×105個(gè)細(xì)胞。一組中加入同等數(shù)量的用HK1、HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理過的中性粒細(xì)胞；另外一組放入0.4 μm孔徑的Transwell小室，在小室上層加入同等數(shù)量的用HK1、HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理過的中性粒細(xì)胞，置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)18 h后測(cè)CD69的表達(dá)，培養(yǎng)96 h后測(cè)PD-1的表達(dá)。將上述經(jīng)過處理的T細(xì)胞收集離心，加入提前稀釋好的Zombie染料（1∶1 000）重懸細(xì)胞，4 ℃避光孵育20 min；離心、棄上清液，加入抗人CD8a抗體、抗人CD69抗體或抗人PD-1抗體，混勻；4℃避光處理15 min；離心后棄上清液，加入200 μL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，立即使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)CD8+T的CD69和PD-1的表達(dá)。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 25.0軟件分析結(jié)果數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 9.0軟件繪制圖表，F(xiàn)lowJo V10軟件分析流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并繪制圖片。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)均以±s表示，均數(shù)檢驗(yàn)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（雙側(cè)），等級(jí)資料的相關(guān)分析采用卡方檢驗(yàn)，生存曲線的繪制采用Kaplan-Meier法，單因素分析應(yīng)用Log-Rank test法，多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。以P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD8+T細(xì)胞和TAN在NPC組織中的浸潤(rùn)情況

為了研究CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)與EBV感染之間的關(guān)系，首先對(duì)NPC的組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，初步分析CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。染色結(jié)果（圖1A、B）顯示，相比于EBV陰性的腫瘤組織，CD8+T細(xì)胞在EBV陽性的NPC組織中的浸潤(rùn)明顯增多（P＜0.000 1）。進(jìn)一步在NPC連續(xù)組織切片的H-E染色中發(fā)現(xiàn)，EBV陽性NPC組織中有大量多型核細(xì)胞浸潤(rùn)，而EBV陰性腫瘤組織中這類細(xì)胞出現(xiàn)較少（圖1A）。考慮到在腫瘤組織浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞中，形態(tài)呈多型核的細(xì)胞主要為TAN。因此，利用相對(duì)應(yīng)的NPC組織切片進(jìn)行TAN標(biāo)志物MPO的免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果（圖1C、D）證實(shí)，在EBV陽性NPC中，腫瘤組織中有更多的TAN浸潤(rùn)（P＜0.000 1）。

TAN在NPC組織中不僅呈現(xiàn)出了與CD8+T細(xì)胞相同的分布規(guī)律，并且與后者的數(shù)量存在著明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。分析結(jié)果（圖1E）顯示，在EBV陽性的NPC組織當(dāng)中，MPO陽性的細(xì)胞數(shù)越多，CD8+T細(xì)胞的數(shù)量越少（r=-0.505 1，P=0.005 2），而這種相關(guān)性在EBV陰性的腫瘤組織中并未體現(xiàn)。

2.2 MPO的表達(dá)與EBV陽性NPC患者的臨床特征和生存預(yù)后的關(guān)系

為了進(jìn)一步探索EBV陽性NPC腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)增多的TAN與CD8+T細(xì)胞之間的關(guān)系以及其臨床意義，本課題組調(diào)取了中山大學(xué)腫瘤防治中心在2008年至2012年期間收治的118例經(jīng)病理確診、初治且無轉(zhuǎn)移、EBER檢測(cè)為陽性的NPC患者治療前的石蠟包埋腫瘤組織切片。將這118例腫瘤組織的連續(xù)切片進(jìn)行MPO和CD8的免疫組化染色。染色結(jié)果用HALO分析軟件進(jìn)行病理評(píng)分，得到H-score。圖2A即MPO染色的代表性組織切片及其相對(duì)應(yīng)的CD8免疫組化染色圖。將這118例NPC組織切片的MPO H-score與CD8 H-score進(jìn)行相關(guān)性分析（圖2B），進(jìn)一步證實(shí)了在EBV陽性NPC組織中，MPO+細(xì)胞的數(shù)量與CD8+細(xì)胞的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.220 2，P=0.016 6）。

根據(jù)MPO H-score的結(jié)果，用ROC求取其截?cái)嘀?。根?jù)截?cái)嘀祵?18例EBV陽性NPC患者分為MPO高表達(dá)組（69例）和MPO低表達(dá)組（49例），采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗(yàn)比較兩組患者10年總生存時(shí)間（OS）和10年無進(jìn)展生存時(shí)間（PFS）的差異。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，相比于MPO低表達(dá)的患者，MPO高表達(dá)的患者具有更短的OS（P=0.025，圖2C）和更短的PFS（P=0.027，圖2D）。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估影響NPC患者10年OS和10年P(guān)FS的獨(dú)立預(yù)后因子，納入的變量包括年齡、性別、T分期、N分期、M分期、臨床分期及MPO表達(dá)水平。結(jié)果（表1）顯示，年齡、臨床分期和MPO表達(dá)水平是影響EBV陽性NPC患者10年OS的獨(dú)立預(yù)后因子，MPO高表達(dá)與EBV陽性NPC 患者更短的 OS（P=0.035，HR=3.09，95%CI：1.15～8.29）密切相關(guān)，年齡和臨床分期還影響了EBV陽性NPC患者10年P(guān)FS。將患者的臨床基本特征與MPO的表達(dá)水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同T分期（T1～2和T3～4）患者的MPO表達(dá)水平存在顯著差異（P=0.028）（表2）。在T1～2分期的EBV陽性NPC患者中，MPO表達(dá)水平高的患者所占比例達(dá)51.9%；而在T3～4分期的EBV陽性NPC患者中，MPO表達(dá)水平高的患者所占比例高達(dá)73.0%。

表1 EBV陽性NPC患者10年OS和10年P(guān)FS的單因素和多因素分析

表2 EBV陽性NPC患者臨床基本特征與MPO的表達(dá)水平之間的關(guān)系[n(%)]

2.3 HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液可誘導(dǎo)TAN向N2型方向極化

基于上述研究結(jié)果推測(cè)，EBV陽性NPCTME中的TAN具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，為N2型中性粒細(xì)胞。為了證實(shí)這一推測(cè)，用密度梯度離心法分離出健康志愿者外周血中的中性粒細(xì)胞。如圖3A、B所示，此方法分離出的細(xì)胞中有90%以上的細(xì)胞為中性粒細(xì)胞，細(xì)胞核呈分葉形?？紤]到中性粒細(xì)胞的存活時(shí)間短，在中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入了凋亡抑制劑Q-VD-OPh以延長(zhǎng)其存活時(shí)間。結(jié)果表明，在加入凋亡抑制劑的情況下，中性粒細(xì)胞存活時(shí)間可延長(zhǎng)至第4天，其存活率仍可達(dá)50%左右。

在此基礎(chǔ)上，將無血清培養(yǎng)基和HK1、HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液與完全培養(yǎng)基1∶1混合，培養(yǎng)分離出的TAN，并于培養(yǎng)24、48和96 h后測(cè)定其N2型標(biāo)志物 CD182（圖4A、B）和CD206（圖4C、D）的表達(dá)。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24 h后，相比于對(duì)照組，HK1、HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)的TAN表面的CD182和CD206有上升的趨勢(shì)，EBV陽性組的上升趨勢(shì)更明顯，但是與陰性組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異；培養(yǎng)48 h后，HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理的TAN的CD182和CD206表達(dá)進(jìn)一步升高，并且EBV陽性組的中性粒細(xì)胞表達(dá)的CD182與對(duì)照組產(chǎn)生了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（P＜0.05）；培養(yǎng)96 h后，各組的TAN表達(dá)的N2型標(biāo)志物均有升高，相比于EBV陰性組，EBV 陽性組中的 TAN 表達(dá)的 CD182（P＜0.001）和CD206（P＜0.01）升高顯著。

2.4 HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液極化后的TAN抑制CD8+T細(xì)胞的活化

為了在體外驗(yàn)證TAN對(duì)CD8+T細(xì)胞的影響，將上述用HK1、HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)極化4 d后的TAN和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)其活化的標(biāo)志物。為了更加明確TAN和CD8+T細(xì)胞之間的作用方式，將共培養(yǎng)系統(tǒng)分為了兩組：一組采用TAN和T細(xì)胞直接混合的共培養(yǎng)方式，另外一組采用了0.4 μm的Transwell小室，上室接種TAN，下室鋪同等數(shù)量的CD8+T細(xì)胞，模擬間接接觸的作用方式。結(jié)果顯示，在間接接觸的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，與對(duì)照組相比，CD8+T細(xì)胞受到HK1、HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液極化后TAN的影響，其表面活化標(biāo)志物CD69的表達(dá)呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)（P＜0.01）（圖5A）。然而，在直接混合的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD8+T細(xì)胞在與極化后的中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)18 h后，其表面活化標(biāo)志物CD69的表達(dá)明顯下降（P＜0.000 1），且EBV陽性組和陰性組之間具有顯著差異（P＜0.001）：與EBV陰性組相比，經(jīng)HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理過后的TAN能更明顯地抑制T細(xì)胞表面的CD69表達(dá)（圖5B）。

除此之外，在共培養(yǎng)4 d后，與對(duì)照組相比，CD8+T細(xì)胞受到HK1、HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液極化后TAN的影響，其細(xì)胞表面PD-1表達(dá)升高（P＜0.001），且EBV陽性組中的PD-1升高程度大于陰性組（P＜0.05）（圖5C）。當(dāng)CD8+T細(xì)胞與極化后的TAN直接接觸培養(yǎng)后，其表面的PD-1的表達(dá)升高更加明顯（P＜0.000 1），且HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液極化后的TAN能夠刺激T細(xì)胞表達(dá)更多的 PD-1（P＜0.001）（圖5D）。

3 討論

NPC的分布在地域上極不平衡，好發(fā)于東亞和東南亞，中國(guó)尤為鼻咽癌高發(fā)地區(qū)[22]。近年來，隨著放療技術(shù)的提升和其他治療手段的改進(jìn)，早期NPC患者的生存率大大提高，但是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)的NPC患者仍無法得到有效的救治[23]。因此，亟待尋找更有效的NPC治療方法。隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑的興起，以PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫治療大大改變了目前腫瘤治療的局面，為患者帶來了長(zhǎng)期生存的希望。有關(guān)PD-1/PD-L1單抗在NPC治療中的應(yīng)用研究也在如火如荼地開展。有研究[24]顯示，PD-1單抗在治療晚期或復(fù)發(fā)的NPC中具有顯著的療效。但是，也有研究[22]表明，仍有部分NPC患者使用PD-1抗體療效差，其原因尚不清楚。研究[25]發(fā)現(xiàn)，EBV陽性NPC患者的腫瘤微環(huán)境中有大量耗竭的CD8+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。EBV感染可激活A(yù)TR通路，加速TAM向M2的轉(zhuǎn)化[7]。這些發(fā)現(xiàn)提示，EBV感染在形成NPC免疫抑制微環(huán)境，幫助NPC細(xì)胞發(fā)生免疫逃避的過程中發(fā)揮了重要的作用。因此，深入了解NPC腫瘤微環(huán)境發(fā)生的變化，對(duì)認(rèn)識(shí)免疫治療在NPC中的作用具有重要意義。

本研究首先通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，在EBV陽性NPC組織中有更多的CD8+T細(xì)胞和TAN浸潤(rùn)，更為重要的是，這兩者在數(shù)量上呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。通過對(duì)118例人EBV陽性NPC組織標(biāo)本進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)EBV陽性NPC組織中高表達(dá)的TAN與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，且TAN是EBV陽性NPC患者總生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因子。中性粒細(xì)胞是一種多型核固有免疫細(xì)胞，也是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分[26]。近年來，人們將腫瘤組織中的中性粒細(xì)胞統(tǒng)稱為TAN。根據(jù)TAN對(duì)腫瘤產(chǎn)生的作用，可分為N1型和N2型。N1型TAN起抗腫瘤作用，N2型TAN起促腫瘤作用[27-28]。因此推測(cè)，EBV陽性NPC腫瘤微環(huán)境中的TAN為N2型。本研究進(jìn)一步證實(shí)，與HK1細(xì)胞培養(yǎng)上清液相比，HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液可使TAN表達(dá)更多的N2型標(biāo)志物：CD182、CD206。N2型TAN是抑制性腫瘤微環(huán)境中的一個(gè)重要組成部分，可通過多種機(jī)制發(fā)揮免疫抑制作用，例如N2型TAN可抑制CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能[29]，并可促進(jìn)其凋亡[30]；可分泌促腫瘤發(fā)生發(fā)展的物質(zhì)，例如N2型TAN分泌的MMP9能通過VEGF-A的作用，誘導(dǎo)腫瘤血管的生成[31]；N2型TAN可分泌細(xì)胞外網(wǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[9,10,32]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HK1-EBV細(xì)胞培養(yǎng)上清液極化后的N2型TAN可以抑制CD8+T細(xì)胞的活化，降低其CD69的表達(dá)并促進(jìn)其PD-1的表達(dá)。

越來越多的研究[7,21,33-34]證明，EBV感染影響了腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境之間的相互作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)：在EBV陽性NPC中，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多并極化成為N2型TAN，可抑制CD8+T細(xì)胞的活化，參與形成免疫抑制微環(huán)境，與NPC患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。本課題組將進(jìn)一步深入研究N2型TAN通過抑制CD8+T細(xì)胞參與腫瘤免疫逃逸的具體機(jī)制并通過N2型TAN相關(guān)的靶向清除劑進(jìn)一步提高針對(duì)EBV陽性NPC的臨床腫瘤免疫治療療效。