張陳，劉平，于曉杰，劉劍飛，欽可為，吳成林，▲，周麗君（1.安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院，安徽 合肥 230032；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 a.中心實(shí)驗(yàn)室；b.耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部；c.全科醫(yī)學(xué)科，北京 100048）

免疫檢查點(diǎn)抑制劑能夠阻斷腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與TIL相互作用中的抑制性信號(hào)，恢復(fù)TIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視功能，促進(jìn)抗腫瘤的作用，成為抗腫瘤藥物研發(fā)熱點(diǎn)[1]。淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyteactivation gene 3，LAG3）主要表達(dá)于TIL細(xì)胞表面，通過與腫瘤細(xì)胞上MHC-Ⅱ類分子（MHC-Ⅱ）結(jié)合，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，成為繼PD-1及CTLA-4后免疫檢查點(diǎn)抑制劑的新興靶點(diǎn)[2-3]。至今已有30余種LAG3抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，在黑色素瘤、乳腺癌、NSCLC和胃癌等疾病中取得良好的療效[4-8]。前期，本課題組通過噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選及工程化改造獲得了一株靶向LAG3的具有高親和力、高特異性的新型全人源IgG4單克隆抗體（mAb），能夠有效阻斷LAG3與其配體MHC-Ⅱ的結(jié)合；在轉(zhuǎn)入LAG3基因的MC38結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，該mAb單獨(dú)使用及聯(lián)合抗PD-1單抗均能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)[9]；在15例晚期實(shí)體瘤患者療效評(píng)估中，發(fā)現(xiàn)該mAb的疾病控制率（disease control rate，DCR）為66.7%[10]。為探討其抗腫瘤作用機(jī)制，本課題組嘗試構(gòu)建LAG3+Jurkat細(xì)胞與MHC-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型，模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境中TIL和腫瘤細(xì)胞的相互作用，評(píng)價(jià)抗LAG3 mAb功能并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探索，為其將來臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

人白血病T細(xì)胞Jurkat購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)，人胃癌細(xì)胞MGC-803、HGC-27和NSCLC細(xì)胞A549均由本實(shí)驗(yàn)室保存?？筁AG3 mAb由南京維立志博生物公司饋贈(zèng)，兔抗人MHC-Ⅱ、LAG3、β-actin一抗和Alexa Fluor?488、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，RPMI 1640液體培養(yǎng)基、FBS購(gòu)自美國(guó)Corning公司，CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自日本同仁公司，植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，BCA試劑盒購(gòu)自北京陽(yáng)光英銳生物科技有限公司，人IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-6的ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將Jurkat、HGC-27、MGC-803和 A549細(xì)胞置于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%匯合時(shí)，收集細(xì)胞傳代或用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)PHA對(duì)Jurkat細(xì)胞的毒性作用

取Jurkat細(xì)胞重懸于含PHA（終質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4和5 μg/mL）的培養(yǎng)基中，按5×104個(gè)/孔接種于96孔板中，分別培養(yǎng)48和72 h，以加入PBS（PHA溶劑）的細(xì)胞及單獨(dú)培養(yǎng)基為對(duì)照組（Control組）和空白組。然后在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10 μLCCK-8試劑，37℃處理2 h，通過酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）在450 nm處測(cè)定各孔光密度（D）值，計(jì)算PHA的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性=[1-（D實(shí)驗(yàn)組-D空白組）/（D對(duì)照組-D空白組）]×100%。

1.4 FCM檢測(cè)LAG3和MHC-Ⅱ蛋白在Jurkat細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)水平

收集Jurkat細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，用PBS洗滌2次，分別向細(xì)胞懸液加入抗LAG3（1∶100）或MHC-Ⅱ（1∶100）、同型 IgG 對(duì)照（1∶1 000）抗體室溫下處理0.5 h后，再加入Alexa Fluor?488標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫下處理25 min，重懸于300 μL PBS中，F(xiàn)CM檢測(cè)該兩蛋白的表達(dá)水平。

1.5 免疫熒光法觀察LAG3和MHC-Ⅱ蛋白在Jurkat細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)

Jurkat細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞經(jīng)爬片、固定后，加入抗LAG3或MHC-Ⅱ一抗（1∶100）室溫處理1 h后，再加入Alexa Fluor?488標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫避光處理30 min，用封片劑密封，通過激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 WB法檢測(cè)LAG3和MHC-Ⅱ蛋白在Jurkat細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平

采用RIPA裂解液裂解Jurkat細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，通過BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，經(jīng)10%SDSPAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入抗LAG3（1∶1 000）、MHC-Ⅱ（1∶8 000）或β-actin（1∶5 000）一抗4 ℃過夜孵育，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶6 000）室溫處理1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光劑曝光顯影，以β-actin作為內(nèi)參照。

1.7 CCK-8法檢測(cè)LAG3+Jurkat細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率

分別將HGC-27、MGC-803和A549腫瘤細(xì)胞制備成懸液，以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，作為靶細(xì)胞，待其貼壁后，以不同效靶比（2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1或40∶1）加入效應(yīng)細(xì)胞LAG3+Jurkat或同時(shí)加入不同劑量（0.25、0.5、1、2或4 μg/mL）抗LAG3 mAb共培養(yǎng)48 h，以不加處理的腫瘤細(xì)胞為對(duì)照組（Control組），以等容積培養(yǎng)基為空白組。使用PBS洗去懸浮的LAG3+Jurkat細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃處理2 h后，通過酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的D值，殺傷率=[1-（D實(shí)驗(yàn)組-D空白組）/（D對(duì)照組-D空白組）]×100%。

1.8 ELISA法檢測(cè)抗LAG3 mAb對(duì)LAG3+Jurkat細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系中相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平的影響

在效靶比為10∶1的共培養(yǎng)模型中，加入抗LAG3 mAb（終質(zhì)量濃度為1 μg/mL）后培養(yǎng)48 h，收集上清液，以加入IgG的共培養(yǎng)體系上清為對(duì)照組、單獨(dú)培養(yǎng)基為空白組。按ELISA試劑盒說明方法，檢測(cè)上清液中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-6的分泌水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上主要實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功構(gòu)建活化的LAG3+Jurkat細(xì)胞

Jurkat細(xì)胞經(jīng)PHA刺激后，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果（圖1A）顯示，在用2 μg/mL以上PHA處理48 h以上時(shí)，PHA對(duì)Jurkat細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用（P＜0.01），因此選取對(duì)Jurkat細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用的2 μg/mL刺激48 h進(jìn)行誘導(dǎo)。ELISA法檢測(cè)結(jié)果（圖1B）顯示，PHA組中Jurkat細(xì)胞分泌IL-2的水平顯著高于Control組（P＜0.01），表明PHA成功活化Jurkat細(xì)胞。FCM檢測(cè)結(jié)果（圖1C）顯示，與Control組相比，PHA誘導(dǎo)組Jurkat細(xì)胞LAG3表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。免疫熒光法和WB法檢測(cè)也獲得類似的結(jié)果（圖1D、E）。結(jié)果表明，成功構(gòu)建LAG3+Jurkat細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 MGC-803和A549細(xì)胞中MHC-Ⅱ呈陽(yáng)性表達(dá)

FCM法檢測(cè)結(jié)果（圖2A）顯示，在MGC-803和A549細(xì)胞表面MHC-Ⅱ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為（52.09±3.52）%和（37.21±2.52）%，均顯著高于IgG組（均P＜0.01）；而在HGC-27細(xì)胞表面MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)率僅為（2.41±0.45）%，與IgG組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。免疫熒光法和WB法檢測(cè)也獲得類似的結(jié)果（圖2B、C）。說明MHC-Ⅱ在MGC-803和A549細(xì)胞中陽(yáng)性呈表達(dá)，在HGC-27中幾乎不表達(dá)。

2.3 不同效靶比的共培養(yǎng)模型中LAG3+Jurkat對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，隨著共培養(yǎng)模型中效靶比的增加，LAG3+Jurkat細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用逐漸增強(qiáng)；在效靶比10∶1時(shí)，LAG3+Jurkat細(xì)胞對(duì)HGC-27、MGC-803和A549細(xì)胞殺傷率分別為（43.56±5.09）%、（28.18±1.70）%和（15.78±3.68）%。選擇效靶比10∶1建立LAG3+Jurkat細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)模型，用于后續(xù)對(duì)抗LAG3 mAb功能及機(jī)制探討。

2.4 抗LAG3 mAb增強(qiáng)LAG3+Jurkat細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

CCK-8法檢測(cè)共培養(yǎng)模型中mAb對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果（圖4）顯示，與Control組和IgG組比較，抗LAG3 mAb劑量達(dá)到1 μg/mL后即可顯著增強(qiáng)LAG3+Jurkat細(xì)胞對(duì)MHC-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)的MGC-803和A549細(xì)胞的殺傷作用（均P＜0.05），但對(duì)不表達(dá)MHC-Ⅱ的HGC-27細(xì)胞的殺傷作用無(wú)明顯增強(qiáng)（P＞0.05）。結(jié)果表明，抗LAG3 mAb通過阻斷LAG3與MHC-Ⅱ相互作用增強(qiáng)LAG3+Jurkat細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

2.5 抗LAG3mAb促進(jìn)LAG3+Jurkat細(xì)胞與MHC-Ⅱ+腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系分泌IL-2、IL-10和TNF-α

ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)體系上清液中細(xì)胞因子水平，結(jié)果（圖5）顯示，當(dāng)靶細(xì)胞是MGC-803或A549時(shí)，與Control組和IgG組比較，抗LAG3 mAb使IL-2、IL-10和TNF-α的分泌量顯著升高（P＜0.01），但對(duì)IFN-γ、IL-4和IL-6的分泌水平無(wú)明顯影響（均P＞0.05）；而當(dāng)靶細(xì)胞是HGC-27時(shí)，LAG3組與Control或IgG組的細(xì)胞因子的分泌水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。結(jié)果表明，抗LAG3 mAb能夠阻斷LAG3與MHC-Ⅱ相互作用，促進(jìn)共培養(yǎng)體系向上清液分泌IL-2、IL-10和TNF-α。

3 討論

T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)是體外探討免疫檢查點(diǎn)抑制劑功能及機(jī)制的主要方法，體外共培養(yǎng)能夠排除腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞及炎性因子干擾，模擬腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與TIL作用后產(chǎn)生的免疫逃逸過程[11]。目前，外周血T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)是常用模型之一，但由于血液樣本需要量大、獲取效率低、體外擴(kuò)增相對(duì)困難，并且可能涉及醫(yī)學(xué)倫理問題，故難以獲取足夠量的外周血T細(xì)胞。另一方面，血液樣本無(wú)法長(zhǎng)期保存，每次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)都需要采集新鮮血液樣本；而且由于獲取的血液樣本中外周血T細(xì)胞存在個(gè)體差異，也可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性不夠理想。Jurkat細(xì)胞是一種永生化的人T淋巴細(xì)胞系，具有人外周血T細(xì)胞生物特性，不僅有效避免醫(yī)學(xué)倫理問題，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果也相對(duì)穩(wěn)定。目前，通過體外病毒感染或藥物刺激等方式構(gòu)建表達(dá)PD-1或LAG3等免疫檢查點(diǎn)分子的Jurkat細(xì)胞，已被廣泛用于PD-1或LAG3等抑制劑功能及機(jī)制的研究中[12-16]。LI等[17]采用PD-1+Jurkat細(xì)胞與PD-L1+HepG2肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)模型探討鼠源性抗PD-1 mAb的功能及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)抗PD-1 mAb B1C4通過恢復(fù)Jurkat細(xì)胞功能、促進(jìn)IL-2和IFN-γ的分泌從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。BHAGWAT等[12]通過慢病毒感染方法獲得LAG3+Jurkat與高表達(dá)MHC-Ⅱ的Raji淋巴瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，加入抗LAG3 mAb MK-4280阻斷后能夠有效恢復(fù)共培養(yǎng)體系中IL-2及TNF-α的分泌。目前逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒感染方法是使Jurkat細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)LAG3蛋白的主要方法。該方法通過病毒攜帶LAG3基因并將其整合到Jurkat細(xì)胞基因組中，然后經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)LAG3的Jurkat細(xì)胞，但該方法操作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，并且隨著目的基因長(zhǎng)度增加，病毒滴度下降、感染效率降低，同時(shí)實(shí)驗(yàn)操作必須在生物安全水平2級(jí)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，因而其應(yīng)用受到限制[16,18]。體外藥物刺激的方法則較為簡(jiǎn)單、快速、安全，可以使活化的Jurkat細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定地表達(dá)天然LAG3蛋白，更適合用于抗LAG3 mAb的功能及機(jī)制研究。通過體外藥物刺激的方法也已經(jīng)成功應(yīng)用于PD-1/PD-L1抑制劑的研究中[17,19]。因此，本研究嘗試采用體外藥物刺激方法構(gòu)建活化的LAG3+Jurkat細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)模型。因IL-2是Jurkat細(xì)胞活化的重要標(biāo)志分子之一[16-17,20]，本研究使用T細(xì)胞激活劑PHA刺激Jurkat細(xì)胞后首先通過ELISA檢測(cè)Jurkat細(xì)胞分泌IL-2水平，確定Jurkat細(xì)胞被成功活化，然后進(jìn)一步采用FCM、免疫熒光法和WB法檢測(cè)活化后細(xì)胞LAG3表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Jurkat細(xì)胞經(jīng)PHA活化后能夠高表達(dá)LAG3，與已知文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。

前期通過體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)[9]發(fā)現(xiàn)，抗LAG3 mAb能夠有效阻斷LAG3與其配體MHC-Ⅱ的結(jié)合，故本研究選擇了表達(dá)MHC-Ⅱ的腫瘤細(xì)胞MGC-803和A549及不表達(dá)MHC-Ⅱ的腫瘤細(xì)胞HGC-27進(jìn)行抗LAG3 mAb功能評(píng)價(jià)。分別以MGC-803、A549及HGC-27細(xì)胞為靶細(xì)胞，LAG3+Jurkat細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，按照效靶比10∶1建立體外共培養(yǎng)模型，并通過CCK-8法測(cè)定不同劑量抗LAG3 mAb對(duì)殺傷靶細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，1 μg/mL抗LAG3 mAb即可顯著增強(qiáng)LAG3+Jurkat細(xì)胞對(duì)MHC-Ⅱ表達(dá)陽(yáng)性的MGC-803和A549細(xì)胞的殺傷，但對(duì)MHC-Ⅱ表達(dá)陰性的HGC-27細(xì)胞無(wú)明顯影響。MIMURA等[6]通過使用胃癌患者的PBMC建立T細(xì)胞與表達(dá)MHC-Ⅱ的MKN7胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)抗LAG3 mAbH7能夠增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)MKN7細(xì)胞殺傷作用。本研究結(jié)果同樣顯示，采用LAG3+Jurkat細(xì)胞建立共培養(yǎng)模型，LAG3 mAb通過阻斷LAG3/MHC-Ⅱ結(jié)合恢復(fù)Jurkat細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

細(xì)胞因子是一類低分子量的可溶性蛋白質(zhì)，能夠刺激腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞活化、增殖和分化，增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[22]。在PD-1、LAG3等免疫檢查點(diǎn)抑制劑的研究中，分泌到共培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子水平的增加是免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一[16,23-25]。MATSUZAKI等[23]研究發(fā)現(xiàn)，從上皮性卵巢癌組織和腹水中分離出的TIL特異性表達(dá)LAG3，通過抗體阻斷LAG3后能夠明顯恢復(fù)TIL的功能、促進(jìn)IFN-γ、IL-6和IL-10的分泌，從而起到抑制卵巢癌的作用。OKOYE等[16]通過慢病毒感染方法獲得LAG3+Jurkat細(xì)胞并建立與淋巴瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)抗LAG3 mAb能夠通過阻斷MHC-Ⅱ/LAG3促進(jìn)共培養(yǎng)體系中IL-2和TNF-α的分泌。為探討新型抗LAG3 mAb的抗腫瘤作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過ELISA方法檢測(cè)共培養(yǎng)體系上清液中細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示，在陽(yáng)性表達(dá)MHC-Ⅱ的MGC-803和A549共培養(yǎng)體系中，加入抗LAG3 mAb阻斷后，共培養(yǎng)上清液中IL-2、IL-10和TNF-α水平顯著升高，而IFN-γ、IL-4、IL-6則無(wú)明顯變化，提示IL-2、IL-10和TNF-α在抗LAG3 mAb殺傷MGC-803和A549腫瘤細(xì)胞中可能發(fā)揮著重要作用。IL-2主要由活化T細(xì)胞分泌，能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖和活化，從而增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞作用[26]；IL-10與IL-2共同刺激T細(xì)胞時(shí)能夠顯著增強(qiáng)后者對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[27]；TNF-α同樣可通過增強(qiáng)T細(xì)胞功能而殺傷腫瘤細(xì)胞[28]。關(guān)于細(xì)胞因子是由哪類細(xì)胞分泌和分泌增加的機(jī)制，以及是否有其他分子共同參與發(fā)揮抗腫瘤作用，還有待進(jìn)一步探索。

綜上，本研究構(gòu)建了LAG3+Jurkat細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞HGC-27、MGC-803和A549共培養(yǎng)模型模擬腫瘤微環(huán)境中TIL與腫瘤細(xì)胞相互作用，發(fā)現(xiàn)本課題組制備全人源IgG4抗LAG3 mAb通過阻斷LAG3/MHC-Ⅱ相互作用而恢復(fù)LAG3+Jurkat細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞MGC-803和A549的殺傷作用，并且該作用可能與共培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子IL-2、IL-10和TNF-α的水平升高有關(guān)，研究結(jié)果為抗LAG3 mAb應(yīng)用于腫瘤臨床治療提供重要實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，活化的Jurkat細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)模型可以有效地應(yīng)用于探討LAG3免疫抑制劑功能及機(jī)制的研究中。