常鈺涵，戈雨桐，哈文韜，魏曉為，龔涌靈（南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院暨南京市第一醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210006）

隨著人口老齡化和生活方式的改變，近年來中國結(jié)直腸癌發(fā)病率明顯上升，已成為嚴(yán)重威脅人民生命和健康的主要疾病之一。放療在結(jié)直腸癌治療策略中具有十分重要的地位[1-2]，然而腫瘤細(xì)胞放療抵抗往往導(dǎo)致臨床治療失敗，最終影響結(jié)直腸癌患者的生活質(zhì)量與生存[3]。探索腫瘤放療抵抗機(jī)制對(duì)于提升結(jié)直腸癌整體治療效果具有重要的轉(zhuǎn)化意義。腫瘤干細(xì)胞參與腫瘤放療抵抗的發(fā)生，但由于腫瘤微環(huán)境的高度異質(zhì)性以及傳統(tǒng)鑒定方法的局限性，腫瘤干細(xì)胞應(yīng)激防御特征與機(jī)制目前尚未完全闡明[4-5]。優(yōu)化腫瘤干細(xì)胞模型、揭示固有放療抗性的形成一直是腫瘤治療抵抗研究領(lǐng)域的難點(diǎn)與熱點(diǎn)，對(duì)提升結(jié)直腸癌臨床療效十分關(guān)鍵?；谏鲜稣J(rèn)識(shí)，本課題組利用一種新型腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞模型——腫瘤再生細(xì)胞（tumor regenerative cell，TRC）模型探索結(jié)直腸癌放療抵抗機(jī)制，并在研究內(nèi)容方面聚焦一種新型細(xì)胞死亡形式——鐵死亡，通過結(jié)合分子生物學(xué)、力學(xué)與生物材料的技術(shù)研究TRC是否通過抵抗鐵死亡進(jìn)而抵抗放療，探討TRC鐵死亡抵抗與放療敏感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。McCoy’s 5A培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、DispaseⅡ、0.45 μm PVDF膜、ECL化學(xué)放光試劑均購自默克公司，纖維蛋白原（salmon fibrinogen）、凝血酶（salmon thrombin）均購自Searun Holdings公司，胰酶替代物、Lipofectamine 2000、C11-BODIPY試劑、TRIzol試劑均購自美國賽默飛公司，Erastin、Deferasirox（Fe3+chelate）均購自MedChemExpress公司，胰蛋白酶、無血清細(xì)胞凍存液均購自蘇州新賽美生物科技有限公司，GoTaq?1-Step RT-qPCR System一步法檢測(cè)試劑盒、MTS試劑盒均購自Promega公司，BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，預(yù)制蛋白膠購自南京金斯瑞生物科技有限公司，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗均購自Proteintech公司，谷胱甘肽過氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗體購自Abcam公司，?；o酶A合成酶長鏈家族成員 4（acyl-coenzyme A synthetase long-chain family member 4，ACSL4）抗體、β-Tublin抗體均購自 Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與三維纖維蛋白軟膠的制備

用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用來做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Control細(xì)胞為常規(guī)培養(yǎng)的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，TRC為三維蛋白軟膠篩選并培養(yǎng)出的HCT116細(xì)胞。參照文獻(xiàn)[6-7]，當(dāng)纖維蛋白原濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)應(yīng)硬度約為90 Pa。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選擇不同硬度的纖維蛋白軟膠（1、1.5、2 mg/mL），配置含纖維蛋白原和T7緩沖液的細(xì)胞混合液，將混合液和凝血酶加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置30 min后補(bǔ)充培養(yǎng)基。次日開始觀察TRC形態(tài)、大小是否均一。

1.3 制備TRC單細(xì)胞懸液

將母液濃度為100 mg/mL的DispaseⅡ溶膠酶稀釋到2 mg/mL的工作濃度，在24孔板的每孔中加入200 μL DispaseⅡ，靜置5 min直至沒有固態(tài)凝膠。將所有細(xì)胞懸液吸出，加入進(jìn)15 mL離心管，離心力為219×g，離心3 min；棄上清，加入3～5 mL胰酶替代物重懸細(xì)胞沉淀，反復(fù)吹打后，置于37℃水浴鍋中5 min，重復(fù)操作直至在顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆離散成單細(xì)胞，獲得TRC單細(xì)胞懸液。

1.4 qPCR實(shí)驗(yàn)

用TRIzol法分別從Control和TRC細(xì)胞中分離提取總RNA，用Nanodrop儀器檢測(cè)總檢測(cè)樣品的RNA濃度。根據(jù)Promega一步法逆轉(zhuǎn)錄qPCR試劑盒的說明書配置溶液；設(shè)置qPCR反應(yīng)程序，并使用2-△△CT相對(duì)定量算法分析結(jié)果。qPCR實(shí)驗(yàn)中所使用的引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.5 MTS法檢測(cè)X-射線照射對(duì)TRC增殖的影響

將Control和TRC分別接種在96孔板中，每孔8×102個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后用X-射線照射，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。根據(jù)Promega試劑盒的要求加入MTS試劑處理2 h，于酶標(biāo)儀下檢測(cè)490 nm波長的光密度（D）值。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組D值/對(duì)照組D值×100%。

1.6WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRC中GPX4、ACSL4的表達(dá)

將Control細(xì)胞和TRC接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中，72 h收集細(xì)胞并提取總蛋白，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。按照預(yù)制膠操作要求進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。用TBST洗膜3次后，分別加入抗β-tublin、GPX4、ACSL4一抗（均按照1∶1 000稀釋）4℃過夜。用TPST洗膜3次，加入相應(yīng)的二抗（按照1∶8 000稀釋）常溫處理1 h，再次用TBST洗膜3次，按照1∶1配置ECL發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，最后使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，計(jì)算處理結(jié)果。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參的條帶灰度值。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRC的放射敏感性

將Control細(xì)胞和TRC接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，給予不同劑量的X-射線照射（2、4、6、8 Gy）后，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集單細(xì)胞懸液，根據(jù)輻照梯度的不同劑量，按照梯度倍數(shù)稀釋的方法稀釋Control和TRC細(xì)胞，接種到6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)2周。定時(shí)觀察培養(yǎng)皿中的細(xì)胞克隆，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可觀察到的克隆之后終止培養(yǎng)。在PBS清洗3次且用甲醛固定細(xì)胞后，加入適量的結(jié)晶紫染劑進(jìn)行染色。細(xì)胞幸存指數(shù)=（處理組克隆形成數(shù)/處理組接種細(xì)胞數(shù)）/Control組克隆形成率×100%；Control組克隆形成率=（Control組克隆形成數(shù)/Control組接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.8 共聚焦顯微鏡觀察TRC的鐵死亡水平

將Control細(xì)胞和TRC接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h，在用不同梯度的X-射線（4、8 Gy）照射后，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。預(yù)先制備C11-BODIPY和Hoechest染色液，每個(gè)樣品所需的染色液體積對(duì)應(yīng)于用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基體積。用PBS清洗3次并加入染液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱處理15 min后，避光條件下用PBS快速?zèng)_洗3次，用共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TRC的脂質(zhì)過氧化水平

取出培養(yǎng)了48 h的Control細(xì)胞和TRC，分別用Erastin和不同劑量的X-射線（4、8 Gy）處理48 h，PBS清洗3次，加入預(yù)先制備的2 μmol/L工作濃度的C11-BODIPY染色液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱處理30 min，PBS清洗3次，將Control細(xì)胞和TRC制備成單細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移到離心管中，離心力為219×g離心3 min，收集細(xì)胞沉淀。重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液通過400目的網(wǎng)篩進(jìn)入流式管中。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平。每個(gè)條件至少獲得1×104個(gè)細(xì)胞顆粒。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 纖維蛋白軟膠篩選的TRC具有高干性和基質(zhì)硬度依賴性

將結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116培養(yǎng)在90 Pa的三維纖維蛋白軟膠中6 d，篩選出TRC（圖1A），在90 Pa的纖維蛋白軟膠中，TRC展現(xiàn)出了良好的形態(tài)和旺盛的增殖能力（圖1B）。在第6天提取HCT116細(xì)胞的總mRNA，通過對(duì)干性基因 CD44、SOX2、TWIST、NANOG、SOX17、BMI1、PTPRT以及分化基因GATA6、CK7等進(jìn)行qPCR檢測(cè)，結(jié)果（圖1C）表明，結(jié)直腸TRC呈現(xiàn)出大量干性基因高表達(dá)且分化基因低表達(dá)的分子模式；且隨纖維蛋白軟膠的硬度（1、1.5、2 mg/mL）改變，干性基因和分化基因的表達(dá)呈現(xiàn)基質(zhì)硬度依賴性。以上數(shù)據(jù)證實(shí)，三維基質(zhì)膠篩選出的TRC為結(jié)直腸癌干性細(xì)胞，可作為結(jié)直腸癌干細(xì)胞研究模型。本研究以狀態(tài)更為穩(wěn)定的HCT116培養(yǎng)的Control細(xì)胞和TRC為研究主體展開后續(xù)功能及機(jī)制研究。

2.2 結(jié)直腸癌TRC具有較高水平的放療抵抗

為了檢測(cè)Control細(xì)胞和TRC對(duì)放療的耐受水平，用不同劑量的X-射線（2、4、6、8 Gy）照射細(xì)胞，MTS法檢測(cè)結(jié)果（圖2A）顯示，TRC細(xì)胞的細(xì)胞存活率均顯著高于Control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 2B、C）表明，在經(jīng)過不同劑量的輻照（0、4、8 Gy)后，TRC的克隆數(shù)量較Control細(xì)胞顯著升高，TRC的細(xì)胞幸存指數(shù)均高于Control細(xì)胞（均P＜0.05）。以上數(shù)據(jù)表明，TRC的放療抵抗能力遠(yuǎn)強(qiáng)于Control細(xì)胞。

2.3 結(jié)直腸癌TRC的放療抵抗與脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)

為了探索結(jié)直腸癌TRC產(chǎn)生放療抵抗?jié)撛诘臋C(jī)制，檢測(cè)鐵死亡與TRC放療抵抗的相關(guān)性。脂質(zhì)過氧化是發(fā)生鐵死亡的重要標(biāo)志，當(dāng)用C11-BODIPY標(biāo)定脂質(zhì)過氧化時(shí)，紅色熒光為還原態(tài)，綠色熒光為氧化態(tài)。本研究用C11-BODIPY對(duì)樣品進(jìn)行染色以檢測(cè)不同處理組細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平，分別采用共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)觀察并標(biāo)定其鐵死亡水平。共聚焦顯微鏡下觀察的結(jié)果（圖3A、B）表明，在經(jīng)過X-射線（4、8 Gy）照射后，與0 Gy組Control細(xì)胞相比，4、8 Gy組Control細(xì)胞的綠色熒光更強(qiáng)，發(fā)生了脂質(zhì)過氧化，并且隨X-射線劑量的增加，Control細(xì)胞的綠色熒光水平也升高；而觀察單個(gè)TRC克隆發(fā)現(xiàn)，各組TRC幾乎沒有綠色熒光，表現(xiàn)出了X-射線抵抗。用鐵螯合劑Deferasirox（Fe3+chelate）（DFO）和8 Gy射線聯(lián)合處理后，結(jié)果顯示，Control細(xì)胞因輻射產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化被逆轉(zhuǎn)，而TRC無明顯改變。另外，C11-BODIPY染色（以30 μmol/L Erastin處理組作為陽性對(duì)照）后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與DMSO組相比，經(jīng)過Erastin處理后的Control細(xì)胞發(fā)生了明顯的脂質(zhì)過氧化（P＜0.05），而TRC沒有發(fā)生脂質(zhì)過氧化（P＞0.05）；Control細(xì)胞在經(jīng)過不同劑量的輻照后（4、8 Gy），和0 Gy組相比，4、8Gy輻照處理組的細(xì)胞發(fā)生了更高水平的脂質(zhì)過氧化（均P＜0.05），而TRC各組的脂質(zhì)過氧化水平?jīng)]有發(fā)生顯著改變（均P＞0.05）（圖3C）。這些結(jié)果表明，結(jié)直腸癌TRC的放療抵抗與脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)，其可能通過抵抗鐵死亡來抵抗放療。

2.4 結(jié)直腸癌TRC可能通過抵抗鐵死亡參與其放療抵抗

為了進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)直腸癌TRC對(duì)鐵死亡的抵抗，本研究對(duì)細(xì)胞行不同濃度鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin處理（實(shí)驗(yàn)組），用C11-BODIPY對(duì)樣品進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其鐵死亡發(fā)生的水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4A、B）表明，在不同濃度的Erastin處理下，Control細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組脂質(zhì)過氧化水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但沒有觀察到濃度依賴性；各組TRC脂質(zhì)過氧化水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明結(jié)直腸癌TRC顯著抵抗鐵死亡。因此推測(cè)，結(jié)直腸癌TRC可能通過抵抗鐵死亡參與其放療抵抗。

2.5 結(jié)直腸癌TRC可能通過高表達(dá)GPX4和低表達(dá)ACSL4抵抗鐵死亡

為了進(jìn)一步探索結(jié)直腸癌TRC抵抗鐵死亡的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)了結(jié)直腸TRC中鐵死亡關(guān)鍵調(diào)控分子GPX4和ACSL4的表達(dá)水平。在細(xì)胞培養(yǎng)的第6天收取Control細(xì)胞和TRC樣品的總RNA，qPCR法檢測(cè)結(jié)果（圖5A）表明，與Control細(xì)胞相比，TRC高表達(dá)GPX4、低表達(dá)ACSL4（均P＜0.05）；在細(xì)胞培養(yǎng)的第6天收取0 Gy或8 Gy處理組的Control細(xì)胞和TRC總蛋白，WB法檢測(cè)結(jié)果（圖5B、C）表明，經(jīng)8 Gy射線處理后，Control細(xì)胞的ACSL4蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，GPX4相對(duì)表達(dá)水平下降，而TRC與之相反（均P＜0.05）；在細(xì)胞培養(yǎng)的第6天收取不同濃度的Erastin處理后（實(shí)驗(yàn)組）的Control和TRC細(xì)胞總蛋白，WB法檢測(cè)結(jié)果（圖6）證實(shí)，與DMSO組相比，實(shí)驗(yàn)組Control細(xì)胞低表達(dá)GPX4、高表達(dá)ACSL4，TRC則與之相反（均P＜0.05）；相比Control細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組，TRC的實(shí)驗(yàn)組高表達(dá)GPX4、低表達(dá)ACSL4，并且隨著Erstin的濃度升高，GPX4的表達(dá)量升高，ACSL4的表達(dá)量隨之降低（均P＜0.05）。這些數(shù)據(jù)提示，結(jié)直腸癌TRC在鐵死亡誘導(dǎo)條件下，可能通過高表達(dá)GPX4和低表達(dá)ACSL4抵抗鐵死亡。

3 討論

結(jié)直腸癌是較為常見的消化道惡性腫瘤之一，放射治療作為其重要的治療方式，被廣泛推薦應(yīng)用于T3期以上或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且無全身轉(zhuǎn)移的中晚期直腸癌患者的治療[8]，其主要模式為新輔助/輔助治療、根治性治療、轉(zhuǎn)化性治療和姑息治療[9]。但是放療的療效并不理想，僅有1/3的患者對(duì)放療相對(duì)敏感，甚至有些患者會(huì)出現(xiàn)放療抵抗[10]。因此，確定放療抵抗的原因及其分子機(jī)制對(duì)于優(yōu)化結(jié)直腸癌患者的治療方案至關(guān)重要。

目前的研究結(jié)果多支持結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞是結(jié)直腸癌治療抵抗和疾病復(fù)發(fā)的根源，常規(guī)療法通常針對(duì)增殖和成熟的腫瘤細(xì)胞，而結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞大多處于靜止?fàn)顟B(tài)且分化較差，因此容易在放化療的損傷中存活[11]。2012年，LIU等[6]基于細(xì)胞外基質(zhì)的物理特性對(duì)細(xì)胞干性及轉(zhuǎn)化的調(diào)控研究[7]結(jié)果，在硬度約為90 Pa的三維纖維蛋白軟膠中培養(yǎng)并篩選出了具有高致瘤能力的TRC，其能夠驅(qū)使腫瘤形成和轉(zhuǎn)移。本研究在纖維蛋白軟膠中篩選和培養(yǎng)出具有高致瘤能力、高干性的結(jié)直腸癌TRC，進(jìn)一步通過MTS法及克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TRC經(jīng)放療后仍具有良好的細(xì)胞增殖能力，相較于常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞能有效抵抗放療損害，這與DAS等[11]的發(fā)現(xiàn)一致。

目前，TRC通過何種機(jī)制發(fā)揮其放療的抵抗作用仍不明確，本研究的結(jié)果數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸癌TRC可能通過抵抗鐵死亡參與其放療抵抗。鐵死亡是一種鐵離子依賴性的、以細(xì)胞內(nèi)ROS堆積為主要特征的非凋亡性細(xì)胞壞死[12]，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的抵抗[13]。GPX4能夠利用谷胱甘肽將過氧化的脂質(zhì)還原成無毒的脂醇，從而抵抗鐵死亡，這也是細(xì)胞抵抗鐵死亡的重要機(jī)制之一[14]。因此，細(xì)胞可能通過高表達(dá)鐵死亡的負(fù)調(diào)控因子GPX4從而抵抗放療[15]。另外，ACSL4能夠?qū)⒂坞x脂肪酸轉(zhuǎn)化為鐵死亡所需的脂酰CoA，從而驅(qū)動(dòng)鐵死亡[12，16-18]。放療會(huì)通過上調(diào)ACSL4的表達(dá)促進(jìn)鐵死亡所需的重要中間產(chǎn)物的生物合成[19]，因此缺失ACSL4的細(xì)胞能夠顯著抵抗GPX4抑制誘導(dǎo)的鐵死亡[20]。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)，與Control細(xì)胞相比，TRC中GPX4呈高表達(dá)、ACSL4呈低表達(dá)，并且隨著Erastin的濃度升高，GPX4的表達(dá)量升高、ACSL4的表達(dá)量降低。這些數(shù)據(jù)都提示了TRC具有天然抵抗鐵死亡的潛能。功能實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，放療誘發(fā)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的鐵死亡以及TRC的鐵死亡抵抗。

綜上所述，本研究通過模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)真實(shí)的物理生存環(huán)境，建立具有干性的結(jié)直腸癌TRC模型，并以該模型研究TRC的放療抵抗機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其可能通過高表達(dá)GPX4，低表達(dá)ACSL4抵抗鐵死亡，從而抵抗放療的潛在機(jī)制。本研究提出的TRC抵抗鐵死亡的現(xiàn)象與當(dāng)前鐵死亡研究領(lǐng)域認(rèn)為的鐵死亡或可特異性靶向腫瘤干細(xì)胞的觀點(diǎn)是沖突的，但也是新穎的，為結(jié)直腸癌鐵死亡誘導(dǎo)療法提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)未來腫瘤的鐵死亡療法的臨床轉(zhuǎn)化有一定的參考價(jià)值。同時(shí)，本研究仍存在諸多局限性，如對(duì)于TRC可能通過鐵死亡抵抗放療的研究較為淺顯，目前發(fā)現(xiàn)了GPX4、ACSL4等關(guān)鍵的鐵死亡調(diào)控分子在其中發(fā)揮重要作用，而更深入的機(jī)制以及有臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值的新靶點(diǎn)有待未來更為深入的探索。