王 慧 張 鑫 薛乾隆 韓樹池 李文卉 趙婷婷

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院急診ICU，張家口 075000）

膿毒癥是感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)并導(dǎo)致器官功能損害、危及生命的癥候群，臨床救治難度大、病死率高［1-2］。肝臟是膿毒癥發(fā)病過程中常見的受累臟器，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等是目前已知與膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷密切相關(guān)的環(huán)節(jié)［3］。沙棘多糖是植物沙棘果實(shí)、根葉中重要的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，國內(nèi)劉芳等［4］的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)沙棘多糖在急性肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，但沙棘多糖在膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制尚不十分清楚。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ）是一類參與炎癥及凋亡調(diào)控的甾體核激素受體，在膿毒癥、缺血再灌注、高脂飲食等誘導(dǎo)肝損傷的過程中表達(dá)減少，并且使用PPARγ激動劑能夠顯著減輕肝損傷并抑制肝臟內(nèi)的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡［5-8］。國內(nèi)劉芳等［4］在急性肝損傷小鼠中觀察到沙棘多糖能夠上調(diào)肝臟中PPARγ 的表達(dá)，提示沙棘多糖的肝臟保護(hù)作用可能與上調(diào)PPARγ 表達(dá)有關(guān)?；诖颂岢黾僬f，沙棘多糖能夠在膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷的過程中通過調(diào)控PPARγ 起到肝臟保護(hù)作用。為了驗(yàn)證這一假說，本研究將以肝臟特異性PPARγ 敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，觀察沙棘多糖減輕膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 野生型C57BL/6J 小鼠購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物公司，肝臟組織特異表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠（Alb-Cre 小鼠，遺傳背景C57BL/6J）、PPARγfl/fl純合小鼠（遺傳背景C57BL/6J）購自上海南方模式生物公司。

1.1.2 試劑與儀器 沙棘多糖購自陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司；HE 染色試劑盒購自上海歌凡生物；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司；PPARγ、NF-κB、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3 及β-actin 的一抗購自Abcam 公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的檢測試劑盒購自上海晶抗生物工程公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 的ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)公司；正置顯微鏡為日本Nikon 公司；凝膠電泳及成像系統(tǒng)為上海天能公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 肝臟特異性PPARγ 敲除小鼠的構(gòu)建 Alb-Cre 小鼠與PPARγfl/fl小鼠雜交，得到Alb-Cre＋/－PPARγfl/?雜合子小鼠，子代小鼠繼續(xù)交配，篩選出Alb-Cre+/+PPARγfl/fl的小鼠，即為肝臟特異性PPARγ敲除小鼠。

1.2.2 動物分組、造模及給藥 野生型C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為WT 組、WT+膿毒癥組、WT+膿毒癥+沙棘多糖組；肝臟特異性PPARγ 敲除小鼠隨機(jī)分為PPARγ-KO 組、PPARγ-KO+膿毒癥組、PPARγ-KO+膿毒癥+沙棘多糖組。根據(jù)劉芳等［4］的研究，確定沙棘多糖的治療劑量為200 mg/kg。造模前，WT+膿毒癥+沙棘多糖組和PPARγ-KO+膿毒癥+沙棘多糖組給予200 mg/kg 沙棘多糖灌胃，1 次/d，連續(xù)14 d；其余各組給予等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)14 d。膿毒癥造模方法如下：末次灌胃后禁食過夜，次日腹腔注射10%水合氯醛（0.3 ml/kg）麻醉后，在腹中線做2～4 cm 切口，分離盲腸并在距離盲腸末端0.5 cm 處進(jìn)行結(jié)扎，用21G 注射器針頭全層對穿腸管，以輕擠可見少許糞便流出作為成功穿孔的標(biāo)準(zhǔn)，而后關(guān)腹；WT 組和PPARγ-KO 組以相同的方法開腹、翻動盲腸后還納，不進(jìn)行結(jié)扎和穿孔的操作。造模后10 min，WT+膿毒癥+沙棘多糖組和PPARγ-KO+膿毒癥+沙棘多糖組給予200 mg/kg沙棘多糖灌胃，其余各組給予等劑量生理鹽水灌胃。干預(yù)24 h后進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.3 血清轉(zhuǎn)氨酶水平的檢測 經(jīng)心臟取血約1.5 ml，靜置0.5 h 凝血后3 000 r/min 離心10 min，分離上層血清并采用試劑盒檢測ALT、AST 含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 HE 染色檢測肝臟的病理改變 取血后處死小鼠，收集適量肝臟組織，生理鹽水清洗后用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋并制作病理切片，采用HE染色試劑盒進(jìn)行染色操作，在400 倍顯微鏡下觀察肝臟的病理改變。

1.2.5 TUNEL 法檢測肝臟細(xì)胞的凋亡率 另取肝臟的病理切片，采用TUNEL試劑盒進(jìn)行染色，在400倍顯微鏡下觀察染色情況，凋亡細(xì)胞呈綠色熒光、細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，每張切片隨機(jī)觀察5 個視野并對凋亡細(xì)胞及總細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Western blot 檢測肝臟中PPARγ、NF-κB、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3 的表達(dá) 另取適量肝臟組織，加入RIPA 裂解液后勻漿，提取蛋白并采用BCA 試劑盒測定蛋白含量，取含有30 μg 蛋白的樣本進(jìn)行Western blot，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，在1∶1 000 稀釋的PPARγ、NF-κB、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3 一抗或1∶5 000 稀釋的β-actin 一抗中4 ℃孵育過夜。次日，HRP二抗室溫孵育PVDF膜1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.2.7 ELISA 檢測肝臟中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量 按照1.2.6 中的方法提取肝臟組織中的蛋白，采用BCA 試劑盒測定蛋白含量，采用ELISA 試劑盒測定TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量，計(jì)算每毫克蛋白中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 軟件錄入數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用±s表示，多組間的比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝臟中PPARγ 表達(dá)的比較 WT+膿毒癥組小鼠肝臟中PPARγ的表達(dá)水平明顯低于WT組（P<0.05）；WT+膿毒癥+沙棘多糖組小鼠肝臟中PPARγ 的表達(dá)水平明顯高于WT+膿毒癥組（P<0.05）。PPARγ-KO 組、PPARγ-KO+膿毒癥組、PPARγ-KO+膿毒癥+沙棘多糖組小鼠肝臟中均不表達(dá)PPARγ，見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟中PPARγ的表達(dá)水平Fig.1 Expressions level of PPARγ in liver of mice in each group

2.2 各組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平的比較 WT+膿毒癥組小鼠血清中ALT、AST 的水平明顯高于WT 組（P<0.05）；WT+膿毒癥+沙棘多糖組小鼠血清中ALT、AST的水平明顯低于WT+膿毒癥組（P<0.05）；PPARγ-KO 組小鼠血清中ALT、AST 的水平與WT 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；PPARγ-KO+膿毒癥組小鼠血清中ALT、AST 的水平明顯高于WT+膿毒癥組（P<0.05）；PPARγ-KO+膿毒癥+沙棘多糖組小鼠血清中ALT、AST的水平明顯高于WT+膿毒癥+沙棘多糖組（P<0.05），見表1。

表1 各組小鼠血清肝酶水平的比較（±s，n=8）Tab.1 Comparison of serum transaminase levels of mice among each group（±s，n=8）

表1 各組小鼠血清肝酶水平的比較（±s，n=8）Tab.1 Comparison of serum transaminase levels of mice among each group（±s，n=8）

Note：Compared with WT group，1）P<0.05；compared with WT+sepsis group，2）P<0.05；compared with WT+sepsis+seabuckthorn poly‐saccharide group，3）P<0.05.

Groups WT WT+sepsis WT+sepsis+seabuckthorn polysaccharide PPARγ-KO PPARγ-KO+sepsis PPARγ-KO+sepsis+seabuckthorn polysaccharide ALT/（U·L?1）18.42±4.58 129.37±32.371）AST/（U·L?1）22.31±8.39 141.94±29.381）39.38±9.372）36.67±9.222）19.03±5.18 178.57±35.582）20.48±7.84 213.47±39.412）113.47±21.383）109.47±23.383）

2.3 各組小鼠肝臟病理改變的比較 WT 組及PPARγ-KO 組小鼠肝臟細(xì)胞排列整齊、形態(tài)正常；WT+膿毒癥組小鼠肝臟細(xì)胞排列混亂、體積增大并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤；WT+膿毒癥+沙棘多糖組小鼠肝臟病理改變較WT+膿毒癥組減輕；PPARγ-KO+膿毒癥組小鼠肝臟細(xì)胞排列混亂、體積增大及炎癥細(xì)胞浸潤的病理改變較WT+膿毒癥組加重；PPARγ-KO+膿毒癥+沙棘多糖組小鼠肝臟的病理改變較WT+膿毒癥+沙棘多糖組加重，見圖2。

圖2 各組小鼠肝臟病理改變的比較（HE染色，×400）Fig.2 Comparison of pathological changes in liver of mice among each group（HE staining，×400）

2.4 各組小鼠肝臟中NF-κB 表達(dá)及炎癥因子含量的比較 WT+膿毒癥組小鼠肝臟中NF-κB 的表達(dá)水平及TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量明顯高于WT 組（P<0.05）；WT+膿毒癥+沙棘多糖組小鼠肝臟中NF-κB的表達(dá)水平及TNF-α、IL-1β、IL-6的含量明顯低于WT+膿毒癥組（P<0.05）；PPARγ-KO 組小鼠肝臟中NF-κB 的表達(dá)水平及TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量與WT 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；PPARγ-KO+膿毒癥組小鼠肝臟中NF-κB 的表達(dá)水平及TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量明顯高于WT+膿毒癥組（P<0.05）；PPARγ-KO+膿毒癥+沙棘多糖組小鼠肝臟中NF-κB 的表達(dá)水平及TNF-α、IL-1β、IL-6的含量明顯高于WT+膿毒癥+沙棘多糖組（P<0.05，圖3、表2）。

表2 各組小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的比較（±s，n=8）Tab.2 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 contents in liver of mice among each group（±s，n=8）

表2 各組小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的比較（±s，n=8）Tab.2 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 contents in liver of mice among each group（±s，n=8）

Note：Compared with WT group，1）P<0.05；compared with WT+sepsis group，2）P<0.05；compared with WT+sepsis+seabuckthorn poly‐saccharide group，3）P<0.05.

Groups WT WT+sepsis WT+sepsis+seabuckthorn polysaccharide PPARγ-KO PPARγ-KO+sepsis PPARγ-KO+sepsis+sea‐buckthorn polysaccharide TNF-α/（ng·mg?1）0.83±0.13 2.39±0.561）IL-1β/（ng·mg?1）1.27±0.20 3.44±0.751）IL-6/（pg·mg?1）83.48±13.82 203.61±37.691）1.25±0.202）1.78±0.292）132.51±31.492）0.90±0.15 4.38±0.842）1.22±0.28 6.47±0.982）87.65±14.25 294.55±53.382）2.51±0.543）4.47±0.823）203.47±32.743）

圖3 各組小鼠肝臟中NF-κB的表達(dá)水平Fig.3 Expression level of NF-κB in liver of mice in each group

2.5 各組小鼠肝臟中細(xì)胞凋亡的比較 WT+膿毒癥組小鼠肝臟細(xì)胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯高于WT 組，Bcl-2 的表達(dá)水平明顯低于WT組（P<0.05）；WT+膿毒癥+沙棘多糖組小鼠肝臟細(xì)胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 的表達(dá)水平明顯低于WT+膿毒癥組，Bcl-2的表達(dá)水平明顯高于WT+膿毒癥組（P<0.05）；PPARγ-KO 組小鼠肝臟細(xì)胞凋亡率及Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3 的表達(dá)水平與WT 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；PPARγ-KO+膿毒癥組小鼠肝臟細(xì)胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 的表達(dá)水平明顯高于WT+膿毒癥組，Bcl-2 的表達(dá)水平明顯低于WT+膿毒癥組（P<0.05）；PPARγ-KO+膿毒癥+沙棘多糖組小鼠肝臟細(xì)胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 的表達(dá)水平明顯高于WT+膿毒癥+沙棘多糖組，Bcl-2 的表達(dá)水平明顯低于WT+膿毒癥+沙棘多糖組（P<0.05，圖4、圖5、表3）。

表3 各組小鼠肝臟中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3表達(dá)水平的比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of Bcl-2，Bax and Cleaved caspase-3 expression levels in liver of mice among each group（±s，n=8）

表3 各組小鼠肝臟中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3表達(dá)水平的比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of Bcl-2，Bax and Cleaved caspase-3 expression levels in liver of mice among each group（±s，n=8）

Note：Compared with WT group，1）P<0.05；compared with WT+sepsis group，2）P<0.05；compared with WT+sepsis+seabuckthorn poly‐saccharide group，3）P<0.05.

Groups WT WT+sepsis WT+sepsis+seabuckthorn polysaccharide PPARγ-KO PPARγ-KO+sepsis PPARγ-KO+sepsis+seabuck‐thorn polysaccharide Bcl-2 1.00±0.17 0.48±0.071）0.92±0.182）Bax 1.00±0.19 1.89±0.301）0.98±0.142）Cleaved caspase-3 1.00±0.19 2.24±0.451）1.45±0.252）0.97±0.14 0.24±0.052）1.09±0.22 3.02±0.562）1.17±0.19 4.72±0.852）0.64±0.093）1.77±0.303）1.98±0.253）

圖4 各組小鼠肝臟細(xì)胞凋亡的比較Fig.4 Comparison of liver cell apoptosis among each group

圖5 各組小鼠肝臟中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of Bcl-2，Bax and Cleaved caspase-3 in liver of mice in each group

3 討論

肝損傷是膿毒癥發(fā)病過程中常見的并發(fā)癥，國內(nèi)外多項(xiàng)臨床研究均發(fā)現(xiàn)合并肝損傷是膿毒癥患者預(yù)后不良的影響因素［9-10］。因此，需要對膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷進(jìn)行積極防治。沙棘多糖是沙棘中主要的活性成分，具有臟器保護(hù)作用［11-12］。國內(nèi)劉芳等［4］的研究發(fā)現(xiàn)，在D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠中，沙棘多糖灌胃能夠減輕肝損傷。本研究將沙棘多糖用于膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷小鼠的干預(yù)，在盲腸結(jié)扎穿孔建立膿毒癥模型后小鼠血清中ALT及AST 的水平增加、肝臟出現(xiàn)了肝損傷的病理改變；而在沙棘多糖灌胃干預(yù)后，小鼠血清中ALT 及AST 的水平降低、肝損傷的病理改變減輕。以上結(jié)果表明沙棘多糖在膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷的過程中起到保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探究沙棘多糖發(fā)揮保護(hù)作用的分子機(jī)制。

PPARγ 是細(xì)胞內(nèi)重要的核受體，激活后與靶基因啟動子區(qū)域的PPAR 反應(yīng)元件結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。PPARγ 具有強(qiáng)大的抑炎作用，在肝臟、腸道、腦、血管、肺等組織中通過抑制NF-κB 的表達(dá)減少多種炎癥細(xì)胞因子的釋放［6，13-16］。膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，膿毒癥小鼠肝臟中PPARγ 表達(dá)減少，使用PPARγ 激動劑能夠減輕膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷［5-6］。本研究也觀察到在膿毒癥小鼠肝臟中PPARγ 的表達(dá)明顯減少，與既往其他學(xué)者的研究結(jié)果吻合，表明PPARγ 可能在膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷過程中起保護(hù)作用，PPARγ 表達(dá)減少可能與膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷的發(fā)生有關(guān)。國內(nèi)劉芳等［4］的研究證實(shí)沙棘多糖能夠增加急性肝損傷小鼠肝臟中PPARγ 的表達(dá)，本研究則觀察到沙棘多糖能夠上調(diào)膿毒癥小鼠肝臟中PPARγ 的表達(dá)，提示沙棘多糖在膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷中的保護(hù)作用可能與上調(diào)PPARγ表達(dá)有關(guān)。

為了驗(yàn)證PPARγ 在沙棘多糖減輕膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷中的作用，本研究采用LoxP-Cre 系統(tǒng)獲得了肝臟特異性PPARγ 敲除小鼠。在特異性敲除肝臟中PPARγ 的表達(dá)后進(jìn)行膿毒癥建模，結(jié)果觀察到敲除PPARγ 后膿毒癥誘導(dǎo)的肝損傷明顯加重，與既往研究報(bào)道PPARγ 激動劑減輕膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷的結(jié)果吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了PPARγ 的肝臟保護(hù)作用［5］。在PPARγ 敲除小鼠中，進(jìn)行膿毒癥建模并給予沙棘多糖干預(yù)，肝損傷的病理改變有所改善，血清ALT 及AST 的水平也有所降低，但上述減輕肝損傷的作用明顯弱于沙棘多糖在野生型膿毒癥小鼠中減輕肝損傷的作用，由此說明敲除PPARγ 能夠削弱沙棘多糖減輕膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷的作用，進(jìn)而提示沙棘多糖通過上調(diào)PPARγ 表達(dá)在膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

PPARγ 在肝臟內(nèi)通過抑制NF-κB 表達(dá)發(fā)揮抗炎及抗凋亡作用，為了驗(yàn)證沙棘多糖上調(diào)PPARγ 在膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷中的保護(hù)作用，本研究進(jìn)一步觀察了PPARγ 下游炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的變化［17-18］。NF-κB 是PPARγ 的下游分子，激活后啟動TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大激活；同時，TNF-α還能介導(dǎo)促凋亡作用并加重肝損傷。膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷的相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PPARγ 能夠抑制NF-κB 表達(dá)并發(fā)揮抗炎及抗凋亡作用，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)、下調(diào)促凋亡基因Bax 及Cleaved caspase-3 的表達(dá)［19］。本研究在野生型小鼠中觀察到沙棘多糖灌胃能夠使膿毒癥小鼠肝臟中NF-κB、Bax 及Cleaved caspase-3 表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率及Bcl-2 表達(dá)升高，與其上調(diào)PPARγ 表達(dá)的作用吻合。在PPARγ 敲除的膿毒癥小鼠中，肝臟中NF-κB、Bax 及Cleaved caspase-3 表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡率及Bcl-2 表達(dá)降低，表明PPARγ在膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷中參與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的調(diào)控；而在沙棘多糖灌胃干預(yù)中，敲除PPARγ 能夠使沙棘多糖抑制膿毒癥小鼠肝臟中炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表明沙棘多糖在膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷過程中的抗炎及抗凋亡作用與上調(diào)PPARγ表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沙棘多糖用于膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷的干預(yù)能夠改善肝臟病理改變、抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，同時也能增加肝臟中PPARγ 表達(dá)；在特異性敲除肝臟中PPARγ 表達(dá)后，沙棘多糖的肝臟保護(hù)作用減弱或喪失，進(jìn)而表明沙棘多糖減輕膿毒癥誘導(dǎo)肝損傷的作用與上調(diào)PPARγ表達(dá)有關(guān)。