李淑勤 趙樹強 鄭麗琴 （山西醫(yī)科大學汾陽學院臨床醫(yī)學系內(nèi)科教研室，呂梁 032200）

肺腺癌患者中常見病理類型為轉(zhuǎn)移性肺癌，但轉(zhuǎn)移的分子機制仍未完全闡明，微小RNA（miRNA）調(diào)節(jié)基因表達可參與癌癥的發(fā)展過程，miR-576-3p通過靶向SGK1 可抑制肺腺癌細胞遷移和侵襲［1］。miR-21-5p 通過靶向SET/TAF-1α 促進肺腺癌的進展［2］。miR-145 通過靶向N-cadherin 而抑制肺腺癌細胞的侵襲和遷移［3］。miR-138-5p 通過靶向E 盒結(jié)合鋅指蛋白2（E-box binding zinc finger protein 2，ZEB2）抑制肺腺癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增殖和轉(zhuǎn)移［4］。表明miRNA 可介導肺腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程。miR-221-3p 在非小細胞肺癌細胞中表達水平升高，并可通過靶向p27 促進非小細胞肺癌細胞生長［5］。靶基因預測顯示成纖維細胞生長因子14（fibroblast growth factor-14，F(xiàn)GF14）與miR-221-3p 存在結(jié)合位點，F(xiàn)GF14 在肺腺癌中低表達并發(fā)揮抑癌作用［6］。但miR-221-3p 是否可通過調(diào)控FGF14 的表達從而參與肺腺癌發(fā)生及發(fā)展過程尚未可知。因此，本研究主要探討miR-221-3p 對肺腺癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響，探究其對FGF14的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人支氣管上皮細胞BEAS-2B 與人肺腺癌細胞A549、A-427、PC-9 購自美國ATCC 細胞庫；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；胎牛血清、Lipo‐fectamine2000、Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄合成及qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；miR-inhibitor-NC、miR-221-3p inhibitor、si-NC、si-FGF14 購自廣州銳博生物科技有限公司；MTT 試劑購自美國Sigma公司；凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD 公司；兔抗人FGF14 抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司；兔抗人CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、P21、Bax 抗體購自美國Santa Cruz 公司；HRP 標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染及分組 BEAS-2B、A549、A-427、PC-9 細胞常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長融合度達到80%時進行細胞傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期PC-9 細胞（2.5×105個/ml）接種于96 孔板（100 μl/孔），分別將miR-inhibitor-NC（ACGUAUCGAUGCU）、miR-221-3p inhibitor（CGAUCGUAGCUAUCGU）、si-NC（GCUA‐GUCGAUCGUAGCU）、si-FGF14（GUAGUCGAUGCUAG）、miR-inhibitor-NC+si-NC、miR-221-3p inhibotor、si-NC、miR-221-3p inhibotor+si-FGF14 轉(zhuǎn)染至PC-9 細胞，分別記作miR-inhibitor-NC 組、miR-221-3p inhibitor 組、si-NC 組、si-FGF14 組、miR-inhibitor-NC+si-NC 組、miR-221-3p inhibotor+si-NC 組、miR-221-3p inhibotor+si-FGF14組。

1.2.2 qRT-PCR 檢測細胞中miR-221-3p、FGF14 mRNA 的表達水平 采用Trizol 法提取BEAS-2B、A549、A-427、PC-9 細胞及各組轉(zhuǎn)染后的PC-9 細胞中總RNA，RNA 置于?80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μl，10×RT Buffer 2 μl，dNTP 0.4 μl，Multiscripe RT 1 μl，10×Rand. om Primer 2 μl，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：25 ℃10 min，37 ℃60 min，95 ℃5 min，4 ℃保存。以cDNA 為模板進行qRT-PCR 反應，參照試劑盒說明書配置反應體系，應用美國ABI StepOnePlus 實時熒光定量PCR 儀檢測miR-221-3p（內(nèi)參U6）、FGF14（內(nèi)參GAPDH）mRNA 相對表達量。miR-221-3p 正向引物：5'-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3'，反向引物：5'-TGCTTATGGCAGTGTATTGTT-3'；FGF1 正向引物：5'-AGTCAG-TCGTATCGTAG-3'，反向引物：5'-CGTAGCTATGCTAGCTGAT-3'；U6 正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；GAPDH 正向引物：5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3'，反向引物：5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖 取各組PC-9 細胞接種于96孔板（5×103個/孔），分別轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時向孔內(nèi)加入MTT 溶液（20 μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清，加入DMSO（150 μl/孔），室溫振蕩孵育5 min后應用酶標儀檢測各孔光密度值（OD值）。

1.2.4 Transwell 實驗檢測細胞遷移與侵襲 取各組PC-9 細胞（2.5×105個/ml）加入上室（200 μl/孔），下室加入含有胎牛血清（10%）的培養(yǎng)液（600 μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后采用PBS 洗滌，然后加入多聚甲醛固定（20 min）后進行0.1%結(jié)晶紫染液染色（10 min），應用顯微鏡觀察遷移細胞數(shù)。使用預冷培養(yǎng)液稀釋Matrigel 基質(zhì)膠后加入小室的上室（40 μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)5 h 后加入各組PC-9 細胞懸液，后續(xù)實驗步驟同上，應用顯微鏡觀察侵襲細胞數(shù)。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 各組PC-9 細胞加入預冷PBS 洗滌后棄上清，加入500 μl 結(jié)合緩沖液重懸細胞后分別加入Annexin V-FITC、PI，室溫振蕩孵育10 min 后應用FACS Calibur 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-221-3p 與FGF14 的靶向關系 Targetscan human 預測顯示miR-221-3p 與FGF14 存在靶向關系，分別構(gòu)建野生型載體WT-FGF14 與突變型載體MUT-FGF14，分別將miR-NC、miR-221-3p mimics 與WT-FGF14、MUTFGF14 共轉(zhuǎn)染至PC-9 細胞后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞后檢測相對熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot 檢測FGF14、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、P21、Bax 蛋白表達 各組PC-9 細胞中加入RIPA 裂解液（400 μl）提取細胞總蛋白，采用BCA 法檢測蛋白濃度后進行SDS-PAGE 電泳反應，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別孵育一抗稀釋液（1∶1 000）與二抗稀釋液（1∶2 000），滴加ECL 顯影后應用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測肺腺癌細胞株和正常人支氣管上皮細胞中miR-221-3p 和FGF14 的表達水平 與BEAS-2B細胞比較，肺腺癌細胞A549、A-427、PC-9 中miR-221-3p 的表達水平升高（P<0.05），F(xiàn)GF14 mRNA 及蛋白水平降低（P<0.05），其中miR-221-3p 在肺腺癌細胞PC-9 中的表達水平相對較高，因而選用PC-9細胞進行后續(xù)研究，見圖1。

圖1 肺腺癌細胞株和正常人支氣管上皮細胞中miR-221-3p和FGF14的表達水平Fig.1 Expression levels of miR-221-3p and FGF14 in lung adenocarcinoma cell lines and normal human bronchial epithelial cells

2.2 轉(zhuǎn)染miR-221-3p inhibitor 對肺腺癌細胞PC-9增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與miR-inhibitor-NC組比較，miR-221-3p inhibitor組OD值降低（P<0.05），CyclinD1 蛋白水平降低（P<0.05），P21 蛋白水平升高（P<0.05），與miR-inhibitor-NC組比較，miR-221-3p inhibitor組遷移及侵襲細胞數(shù)減少（P<0.05），MMP-2、MMP-9蛋白水平降低（P<0.05）；與miR-inhibitor-NC組比較，miR-221-3p inhibitor 組凋亡率升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白水平降低（P<0.05），Bax 蛋白水平升高（P<0.05），見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-221-3p inhibitor 對肺腺癌細胞PC-9 增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Fig.2 Effects of transfection of miR-221-3p inhibitor on proliferation，migration，invasion and apoptosis of lung adenocarcinoma cell PC-9

2.3 Targetscan human分析miR-221-3p與FGF14之間存在相互作用，且靶向負調(diào)控 Targetscan human預測顯示miR-221-3p 與FGF14 存在結(jié)合位點，見圖3A。miR-221-3p過表達可明顯降低WT-FGF14的熒光素酶活性（P<0.05），而對MUT-FGF14 的熒光素酶活性無顯著影響（P>0.05），見圖3B。與miR-in‐hibitor-NC 組比較，miR-221-3p inhibitor 組FGF14 mRNA的表達水平升高（P<0.05），見圖3C。

圖3 miR-221-3p靶向負調(diào)控FGF14的表達Fig.3 miR-221-3p targets and negatively regulates expres?sion of FGF14

2.4 沉默F(xiàn)GF14對肺腺癌細胞PC-9增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與si-NC 組比較，si-FGF14 組OD值升高（P<0.05），遷移及侵襲細胞數(shù)增多（P<0.05），凋亡率降低（P<0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05），P21、Bax 蛋白水平降低（P<0.05），見圖4。

圖4 沉默F(xiàn)GF14 對肺腺癌細胞PC-9 增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Fig.4 Effects of silencing FGF14 on proliferation，migra?tion，invasion and apoptosis of lung adenocarcinoma cell PC-9

2.5 沉默F(xiàn)GF14 能逆轉(zhuǎn)干擾miR-221-3p 對肺腺癌細胞PC-9 增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與miRinhibitor-NC+si-NC 組比較，miR-221-3p inhibotor+si-NC 組OD 值降低（P<0.05），遷移及侵襲細胞數(shù)減少（P<0.05），凋亡率升高（P<0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05），P21、Bax蛋白水平升高（P<0.05）；與miR-221-3p inhibotor+si-NC 組比較，miR-221-3p inhibotor+si-FGF14 組OD值升高（P<0.05），遷移及侵襲細胞數(shù)增多（P<0.05），凋亡率降低（P<0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05），P21、Bax 蛋白水平降低（P<0.05），見圖5。

圖5 沉默F(xiàn)GF14 能逆轉(zhuǎn)干擾miR-221-3p 對肺腺癌細胞PC-9增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Fig.5 Silencing FGF14 could reverse effect of interfer?ence miR-221-3p on proliferation，migration，inva?sion and apoptosis of lung adenocarcinoma cell PC-9

3 討論

肺腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，近年來，肺腺癌發(fā)病率與病死率逐年上升，已嚴重威脅人類生命安全，目前肺腺癌發(fā)病機制尚未闡明，已知miRNA 在肺腺癌形成及發(fā)展過程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，miR-210通過靶向賴氨酰氧化酶樣4促進肺腺癌的增殖、遷移和侵襲［7］。miR-204 靶向SOX4 而抑制肺腺癌的轉(zhuǎn)移［8］。miR-195通過直接靶向apelin抑制肺腺癌的進展［9］。但miRNA 在肺腺癌發(fā)生過程中的作用機制尚未完全闡明，因而本研究積極探尋新型miRNA 分子并探究其在肺腺癌形成過程中的作用機制，為肺腺癌治療提供潛在靶點。

miR-221-3p 和miR-15b-5p 通過靶向Axin2 促進肝癌細胞增殖和侵襲［10］。miR-221-3p 靶向THBS2促進子宮頸癌轉(zhuǎn)移［11］。miR-221-3p 通過靶向THBS2 促進宮頸鱗狀細胞癌的血管生成［12］。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌細胞中miR-221-3p 的表達水平升高，提示miR-221-3p 在肺腺癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-221-3p表達可明顯降低肺腺癌細胞活力。已知細胞活力（增殖）與細胞周期密切相關，CyclinD1 在腫瘤中表達水平升高并可促進細胞周期進展，而P21 表達水平升高可誘導細胞周期阻滯［13］。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-221-3p 表達可明顯降低CyclinD1 的表達水平，提高P21的表達水平，提示抑制miR-221-3p表達可抑制肺腺癌細胞增殖。MMP-2、MMP-9 在腫瘤細胞中表達水平升高可通過降解細胞外基質(zhì)沉積從而促進細胞轉(zhuǎn)移［14］。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-221-3p 表達可明顯減少肺腺癌細胞遷移及侵襲細胞數(shù)，降低MMP-2、MMP-9 的表達水平，提示抑制miR-221-3p 表達可抑制肺腺癌細胞遷移及侵襲。細胞凋亡與增殖失衡可促進腫瘤形成及進展，抗凋亡蛋白Bcl-2 在腫瘤中表達水平升高可抑制細胞凋亡，而Bax 表達水平升高可通過線粒體途徑而促進細胞凋亡［15］。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-221-3p 表達可提高肺腺癌細胞凋亡率，促進Bax 表達及抑制Bcl-2表達，提示抑制miR-221-3p表達可促進肺腺癌細胞凋亡。

本研究證實miR-221-3p 可靶向結(jié)合FGF14，并可負向調(diào)控FGF14的表達。FGF14在結(jié)直腸癌中表達水平降低，并可調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 途徑而發(fā)揮腫瘤抑制作用［16］。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌細胞中FGF14 的表達水平降低，進一步研究顯示，沉默F(xiàn)GF14 可明顯提高肺腺癌細胞活力，增加遷移及侵襲細胞數(shù)，還可降低細胞凋亡率，提示FGF14 在肺腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮抑癌基因作用。同時本研究將抑制miR-221-3p 表達與沉默F(xiàn)GF14聯(lián)合作用后細胞活力明顯升高，細胞遷移及侵襲能力明顯增強，而細胞凋亡率明顯降低，提示沉默F(xiàn)GF14 可明顯逆轉(zhuǎn)抑制miR-221-3p 表達對肺腺癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用。

綜上所述，肺腺癌細胞中miR-221-3p 的表達水平升高，而FGF14的表達水平降低，抑制miR-221-3p表達可通過上調(diào)FGF14 的表達從而抑制肺腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，并可促進細胞凋亡，其可能作為肺腺癌治療的潛在靶點。但仍需進行體內(nèi)動物實驗進一步驗證。