曹芹雪 任 璐 田 君 王 寧 張冬麗 李艷云 （河南大學(xué)淮河醫(yī)院婦產(chǎn)科，開封 475000）

宮頸癌是發(fā)病率僅低于乳腺癌的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，是女性死亡的主要病因之一［1-2］。免疫逃逸是指腫瘤細(xì)胞逃避機體免疫系統(tǒng)監(jiān)控，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞失控性增生、轉(zhuǎn)移，在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用［3-4］。因此，解除免疫逃逸，開展免疫治療為改善腫瘤預(yù)后帶來了新的希望。目前某些化療藥物可能通過促進腫瘤免疫原性增強對免疫系統(tǒng)做出獨特貢獻，但其毒副作用較大，患者常因無法耐受而放棄治療［5］。隨著醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展，抗癌藥物研發(fā)熱點已逐漸轉(zhuǎn)向從傳統(tǒng)中藥中分離具有抗腫瘤活性的天然藥物。靈芝多糖（ganoderma lucidum polysaccharides，GLP）提取自赤芝或紫芝干燥子實體，具有抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等藥理作用［6］。已有研究證實，GLP 可通過調(diào)節(jié)免疫功能抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖及體外遷移［7］。目前關(guān)于GLP 對宮頸癌免疫逃逸的影響及機制研究較少，本研究通過建立宮頸癌荷瘤小鼠模型，觀察GLP對其腫瘤及免疫逃逸的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細(xì)胞懸液 SPF 級ICR 雌性小鼠60只，5周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SYXK（京）2019-0022；宮頸癌U14細(xì)胞懸液，購自上海美軒生物科技有限公司。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 GLP（純度>98%，廣州市百芝生物技術(shù)有限公司，批號：Q320981 DCTS009）；ICOS 抑制劑ICOS 單克隆抗體（ICOS‐mAb）（亞諾法生技股份有限公司，批號：MAB6976）；兔抗鼠誘導(dǎo)性共刺激分子（inducible co-stimulator，ICOS）、誘導(dǎo)性共刺激分子配體（inducible co-stimu‐lator ligand，ICOSL）一抗（武漢菲恩生物科技有限公司，批號：FNab04110、FNab04114）；山羊抗兔IgG 二抗（北京百奧萊博科技有限公司，批號：WK355-FOV）；FACSCalibu 流式細(xì)胞儀系統(tǒng)（美國BD 公司）；Glite UV 凝膠成像系統(tǒng)（江蘇偉禾生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組 60 只小鼠中隨機抽取10只設(shè)為正常組，其余50只無菌條件下右腋皮下接種0.2 ml宮頸癌U14細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度1×107個/ml），繼續(xù)回籠飼養(yǎng)。7 d后采用游標(biāo)卡尺測定腫瘤體積，即寬度2×長度/2。腫瘤體積150～250 mm3時提示建模成功。將建模成功的40只小鼠隨機分為荷瘤組、GLP組、抑制劑組、GLP+抑制劑組，各10只。

1.2.2 干預(yù)方式以及測定腫瘤體積 建模成功后當(dāng)天開始干預(yù)。根據(jù)人與動物劑量換算公式確定藥物用量，GLP 組GLP 200 mg/kg 灌胃，與抑制劑組等量的生理鹽水腹腔注射；根據(jù)文獻［8］確定ICOS‐mAb 用量，抑制劑組ICOSmAb 100 μg/kg 腹腔注射，與GLP組等量的生理鹽水灌胃；GLP+抑制劑組藥物用法及用量同GLP 組、抑制劑組；正常組與荷瘤組灌胃、腹腔注射等量生理鹽水。1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。開始干預(yù)后第2、4、6、8、10、12、14天測量，并記錄腫瘤大小。

1.2.3 分離小鼠外周血細(xì)胞 干預(yù)后第14天眼眶采血，取500 μl 新鮮血液，加入3 ml 紅細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解10 min，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑10 cm，棄去上清，再次加入3 ml 紅細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解10 min，3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，棄去上清，PBS重懸，收集細(xì)胞沉淀。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測定外周血髓源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）水平以及CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平 取外周血細(xì)胞懸液（含1×106個細(xì)胞），加入500 μl Binding buffer 懸液懸浮細(xì)胞，加入抗GR-1、CD11b 流式抗體，抗CD4、CD8單克隆抗體，遮光孵育30 min，3 000 r/min，離心10 min，離心半徑10 cm，棄去上清，PBS 洗滌，采用1%多聚甲醛定容，300 目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，4 ℃遮光保存，以陰性對照管設(shè)門，以多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)測定MDSCs 水平以及CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞水平，其中GR-1+、CD11b+雙陽性者為MDSCs。

1.2.5 測定胸腺、脾臟指數(shù) 采血后稱取小鼠體質(zhì)量，脫頸處死小鼠，快速剝離腫瘤塊稱取腫瘤質(zhì)量；剖開胸腔、腹腔，快速分離胸腺、脾臟，PBS 反復(fù)沖洗，去除表面血污，濾紙吸干，稱重，計算胸腺（脾臟）指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.2.6 Western blot 測定腫瘤組織ICOS、ICOSL 蛋白相對表達量 取新鮮腫瘤組織塊，充分研磨后轉(zhuǎn)移至離心管，500 μl RIPA 裂解液冰上裂解，25 min后12 000 r/min，離心10 min，離心半徑8 cm，取上清用BCA 蛋白定量試劑盒定量，恒壓下行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜2 h，封閉液封閉2 h，與兔抗鼠ICOS、ICOSL 一抗（1∶1 000）混合，4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗滌，與山羊抗兔IgG 二抗（1∶5 000）混合后室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法暗室中顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，以ICOS、ICOSL條帶與GAPDH灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件統(tǒng)計、分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，多樣本資料比較用單因素方差分析，如Levene 檢驗方差齊，用單因素方差分析行總均值比較，用LSD-t行兩兩比較，如Levene檢驗方差不齊，用Welch檢驗行總體均值比較，然后用Dunnett T3 檢驗行兩兩比較。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤體積 第10、12、14 天腫瘤體積組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；第10、12、14 天抑制劑組、荷瘤組、GLP+抑制劑組、GLP 組腫瘤體積依次縮?。≒<0.05）。見圖1。

圖1 干預(yù)后各組腫瘤體積Fig.1 Tumor volume after intervention of each group

2.2 胸腺、脾臟指數(shù) 胸腺、脾臟指數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；抑制劑組、荷瘤組、GLP+抑制劑組、GLP 組、正常組胸腺、脾臟指數(shù)依次升高（P<0.05，表1）。

2.3 外周血MDSCs 水平 抑制劑組、荷瘤組、GLP+抑制劑組、GLP 組、正常組外周血MDSCs 占比依次降低（P<0.05，表1、圖2）。

圖2 外周血MDSCs占比Fig.2 Proportion of MDSCs in peripheral blood

表1 胸腺、脾臟指數(shù)比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of thymus and spleen index（±s，n=10）

表1 胸腺、脾臟指數(shù)比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of thymus and spleen index（±s，n=10）

Note：1）P<0.05 vs normal group；2）P<0.05 vs tumor-bearing group；3）P<0.05 vs GLP group；4）P<0.05 vs inhibitor group.

Proportion of MDSCs/%8.02±0.92 53.47±6.821）36.71±4.391）2）62.03±6.951）2）3）44.89±5.271）2）3）4）Groups Normal Tumor-bearing GLP Inhibitor GLP+inhibitor Thymus index/（mg·g?1）4.71±0.52 2.42±0.411）3.98±0.471）2）1.36±0.241）2）3）3.01±0.371）2）3）4）Spleen index/（mg·g?1）6.78±0.74 3.85±0.471）5.98±0.621）2）3.11±0.511）2）3）4.37±0.491）2）3）4）

2.4 外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞占比，CD4+/CD8+比較 外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞占比，CD4+/CD8+組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；抑制劑組、荷瘤組、GLP+抑制劑組、GLP 組、正常組CD4+T淋巴細(xì)胞占比、CD4+/CD8+依次升高，CD8+T淋巴細(xì)胞占比依次降低（P<0.05，表2、圖3、圖4）。

圖3 外周血CD4+T淋巴細(xì)胞占比Fig.3 Proportion of CD4+T lymphocytes in peripheral blood

圖4 Western blot測定ICOS、ICOSL蛋白表達Fig.4 Western blot determination of ICOS and ICOSL protein expression

圖4 外周血CD8+T淋巴細(xì)胞占比Fig.4 Proportion of CD8+T lymphocytes in peripheral blood

表2 外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞占比、CD4+/CD8+比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of CD4+，CD8+T lymphocytes，CD4+/CD8+in peripheral blood（±s，n=10）

表2 外周血CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞占比、CD4+/CD8+比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of CD4+，CD8+T lymphocytes，CD4+/CD8+in peripheral blood（±s，n=10）

Note：1）P<0.05 vs normal group；2）P<0.05 vs tumor-bearing group；3）P<0.05 vs GLP group；4）P<0.05 vs inhibitor group.

CD4+/CD8+1.89±0.21 0.66±0.071）1.38±0.161）2）0.50±0.061）2）3）1.01±0.141）2）3）4）Groups Normal Tumor-bearing GLP Inhibitor GLP+inhibitor CD4+/%61.53±5.41 30.14±4.621）50.24±5.061）2）25.31±3.211）2）3）41.03±5.171）2）3）4）CD8+/%32.54±3.21 45.79±3.951）36.33±3.241）2）50.52±5.171）2）3）40.56±4.011）2）3）4）

2.5 腫瘤組織ICOS、ICOSL 蛋白相對表達量 腫瘤組織ICOS、ICOSL 蛋白相對表達量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；抑制劑組、荷瘤組、GLP+抑制劑組、GLP 組腫瘤組織ICOS、ICOSL 蛋白相對表達量依次升高（P<0.05，表3、圖4）。

表3 腫瘤組織ICOS、ICOSL蛋白相對表達量（±s，n=10）Tab.3 Relative expression of ICOS and ICOSL proteins in tumor tissues（±s，n=10）

表3 腫瘤組織ICOS、ICOSL蛋白相對表達量（±s，n=10）Tab.3 Relative expression of ICOS and ICOSL proteins in tumor tissues（±s，n=10）

Note：1）P<0.05 vs tumor-bearing group；2）P<0.05 vs GLP group；3）P<0.05 vs inhibitor group.

ICOSL 0.30±0.05 0.59±0.061）0.11±0.021）2）0.41±0.051）2）3）Groups Tumor-bearing GLP Inhibitor GLP+inhibitor ICOS 0.22±0.03 0.48±0.051）0.09±0.011）2）0.34±0.041）2）3）

3 討論

研究認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生及發(fā)展實質(zhì)上是宿主與腫瘤細(xì)胞間對抗、博弈的過程，而宿主免疫系統(tǒng)及免疫微環(huán)境的形成是腫瘤進展、轉(zhuǎn)移的重要影響因素［9-10］。從免疫學(xué)角度而言，腫瘤細(xì)胞是一群可不斷表達異常抗原（基因突變、缺失或修飾）與正?？乖ɑ蜻^度表達）的宿主自身組織細(xì)胞，免疫逃逸機制導(dǎo)致機體對其免疫反應(yīng)低下或免疫無應(yīng)答［11］。中藥多糖是具有多種藥理作用的活性物質(zhì)，毒副作用小，逐漸被應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，但并非直接殺滅或損傷腫瘤細(xì)胞，而是激活細(xì)胞與體液免疫反應(yīng)，作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑達到抑制腫瘤的目的，符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過解除免疫逃逸從而治療腫瘤的思路。

胸腺、脾臟是機體重要的免疫器官，脾臟是免疫細(xì)胞定居及免疫應(yīng)答場所，胸腺可誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞分化為T 淋巴細(xì)胞亞群，并經(jīng)淋巴液或血液流動移至外周免疫器官誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，兩者重量改變是衡量自身功能的重要指標(biāo)［12］。MDSCs 是來源于骨髓、介導(dǎo)宮頸癌形成免疫抑制微環(huán)境的關(guān)鍵性免疫抑制細(xì)胞，其被募集至淋巴結(jié)、脾臟、外周血及腫瘤微環(huán)境中，通過抑制T細(xì)胞來削弱機體先天、后天抗腫瘤的免疫功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸［13］。T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是機體抗腫瘤免疫系統(tǒng)的主要組成部分，其根據(jù)細(xì)胞表面分化抗原分為CD4+、CD8+細(xì)胞亞群。研究表明，多數(shù)腫瘤患者CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群占比降低，CD8+T 淋巴細(xì)胞亞群占比相對升高，導(dǎo)致兩者比值降低，反映出機體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)［14］。本研究結(jié)果顯示，與荷瘤組比較，GLP 組第10、12、14天腫瘤體積縮小，胸腺、脾臟指數(shù)提高，外周血MDSCs 占比降低，CD4+/CD8+升高，提示GLP具有抑制腫瘤及解除免疫逃逸的作用。GLP 作為一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，可通過影響樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及T 淋巴細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞，誘導(dǎo)生成細(xì)胞因子，全面發(fā)揮調(diào)節(jié)機體細(xì)胞免疫的作用。LIU 等［15］研究GLP 對小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞增殖具有明顯的促進作用，且可協(xié)同細(xì)胞因子發(fā)揮協(xié)同生長因子、類生長因子的作用，從而發(fā)揮抗癌作用。

抗原特異性T 細(xì)胞需刺激信號激活才能活化，其中共刺激信號由抗原呈遞細(xì)胞表面共刺激分子結(jié)合T 細(xì)胞上對應(yīng)受體產(chǎn)生，不僅對T 細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞因子釋放具有促進作用，并可減少其凋亡，缺乏該信號將造成T 細(xì)胞無能。ICOS 作為共刺激分子CD28家族重要成員，通過結(jié)合其配體ICOSL發(fā)揮作用，放大T 細(xì)胞對外源性抗原的反應(yīng)，ICOS/ICOSL 共刺激通路在細(xì)胞、體液免疫中具有重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，ICOS/ICOSL 在結(jié)直腸癌、胃腸、白血病等中異常低表達，且其與預(yù)后具有相關(guān)性［16-18］。然而，目前關(guān)于ICOS/ICOSL 在宮頸癌免疫逃逸中的作用研究較少，甚至存在矛盾。本研究結(jié)果顯示，采用ICOS 抑制劑干預(yù)后，小鼠腫瘤體積較荷瘤組更大，胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、CD4+/CD8+更低，外周血MDSCs 占比更高，并減弱GLP 的治療作用，且抑制劑組、荷瘤組、GLP+抑制劑組、GLP 組腫瘤組織ICOS、ICOSL 蛋白相對表達量依次升高，推測ICOS、ICOSL 低表達可能參與宮頸癌腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，GLP 對宮頸癌的積極治療作用可能與激活I(lǐng)COS/ICOSL通路有關(guān)。

綜上所述，GLP 可抑制宮頸癌荷瘤小鼠腫瘤生長，抑制免疫逃逸，推測與激活I(lǐng)COS/ICOSL 通路有關(guān)。