林晶英 顏子乙 顏靈逸 李明遠 崔亞利

（四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗科，出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點實驗室,成都 610041）

流感作為一種存在已久的急性發(fā)熱性呼吸道疾病，具有高傳染性。流感病毒主要通過空氣以飛沫傳播為主，也可通過病毒污染的物品間接傳播，人群對流感病毒普遍易感。流感病毒分為甲、乙、丙、丁等四型，其中甲型流感病毒可分為多個亞型，可造成人類嚴重的呼吸道疾病，并引起世界性大流行。本文主要介紹了當(dāng)前控制人類流感感染的疫苗策略，但由于不斷的抗原漂移及減毒活流感疫苗的局限性，迫切的需要開發(fā)新的流感疫苗技術(shù)，評價疫苗的安全性和有效性。因此，本文還研究了反向遺傳學(xué)技術(shù)在新型流感疫苗研制中的應(yīng)用，并對研發(fā)各種新型疫苗的策略進行了敘述與匯總。

1 甲型流感病毒及其疫苗研究

1.1 甲型流感病毒 甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）屬于正黏病毒科病毒，病毒體具有包膜，核酸為單負鏈RNA，并分為8 段。病毒包膜中蛋白質(zhì)最豐富的是血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase,NA），其次是基質(zhì)2（M2）蛋白。根據(jù)HA 和NA 病毒表面糖蛋白的抗原特性，將IAV 分為多個亞型，其中HA有16種（H1至H16），NA有9種（N1 至N9）［1］。目前的季節(jié)性流感中主要出現(xiàn)的是A 型流感H1N1 和H3N2。HA 通過與唾液酸受體結(jié)合，進入細胞病毒包膜與內(nèi)體的融合。此外，HA 對細胞表面唾液寡糖具有特異性，故其是決定病毒趨向性和宿主特異性的主要因素之一［2］。NA 可去除唾液酸，將病毒從感染的細胞中釋放出來。M2蛋白負責(zé)內(nèi)吞及病毒組裝后病毒體的酸化。病毒包膜下，有一個由基質(zhì)1（M1）蛋白組成的蛋白質(zhì)層，參與病毒體組裝及出芽。核轉(zhuǎn)運蛋白（NEP）存在于病毒顆粒內(nèi)，主要作用是將病毒復(fù)制后期的8種vRNP復(fù)合物從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)。這些vRNP 是病毒體的核心，包括被病毒核蛋白（viral nucleoprotein，NP）包裹的8 個vRNA 片段及由酸性聚合酶（acid poly‐merase，PA）、堿性蛋白1 和2（PB1，PB2）3 個亞基組成的RNA 聚合酶（圖1）。8 個vRNA 片段（PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M 和NS）包含較長的中央編碼區(qū)，兩個末端為非編碼區(qū)，這些區(qū)域?qū)τ趘RNA 基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，而且在每個vRNA 片段的3'和5'末端，包含病毒組裝所需的包裝信號［3］。

圖1 甲型流感病毒結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Influenza A virus

乙型流感病毒（influenza B virus，IBV）常引起局限性流行，且只在人類之間傳播。乙型流感病毒同樣由8 個RNA 節(jié)段構(gòu)成，但與IAV 不同的是，IBV 表面除了主要的HA、NA 蛋白和M1 蛋白外，還有BM2離子通道和NB 離子通道，主要用于病毒的脫殼和組裝（圖2）。乙型流感病毒在對宿主細胞的侵染過程同甲型流感病毒大體一致。

圖2 乙型流感病毒結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of Influenza B virus

1.2 當(dāng)前控制人類流感感染的疫苗策略 IAV 每年都會反復(fù)流行，導(dǎo)致人類輕度至重度呼吸系統(tǒng)疾病甚至病死，對公共健康和全球經(jīng)濟構(gòu)成威脅。目前，接種疫苗仍然是避免人類感染季節(jié)性IAV 最有效的手段。盡管每個國家對接種疫苗的策略各不相同，但美國免疫實踐咨詢委員會建議，每年要為所有6 月齡以上的人接種流感疫苗［4］。由于不斷的抗原漂移，因此每年要更新疫苗的配制，以確保疫苗中包含的HA 和NA 與季節(jié)性流行病毒相匹配?？乖剖橇鞲胁《驹趶?fù)制過程中HA 基因和NA基因發(fā)生點突變后累積產(chǎn)生的結(jié)果，發(fā)生抗原漂移的甲型流感病毒可再次感染先前已獲得免疫的宿主，進而導(dǎo)致流感的反復(fù)流行［5］。

目前流感疫苗主要有滅活流感疫苗（inactivate influenza vaccines，IIV）、減毒活流感疫苗（live-atten‐uated influenza vaccines，LAIV）、HA 重組疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗和類病毒顆粒疫苗等幾種，其中IIV 及LAIV 為主［6］。IIV 是預(yù)防流感最常用的疫苗，也是第一批獲得許可的流感疫苗。IIV 于1940 年開始使用，開始為僅包含一種甲型流感病毒亞型的單價制劑，但通過大規(guī)模研究證實其可有效預(yù)防流感流行。IIV 通過將WHO 每年推薦的病毒株與另一株生長迅速的流感病毒共同感染雞胚，在感染后2～3 d 獲得重配病毒。該重配病毒在生長迅速的流感病毒HA、NA 中和抗體存在的條件下，選擇得到包含來自WHO 推薦病毒的HA 和NA 片段及來自生長迅速的流感病毒的6個內(nèi)部片段。將重配病毒純化和濃縮，并用甲醛或β-丙內(nèi)酯滅活即可得到IIV（圖3）［7］。IIV 通過肌注接種，在預(yù)防流感感染相關(guān)的發(fā)病率及病死率方面具有60%～90%的有效性。但是，IIV 誘導(dǎo)的T 細胞所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有限，且該免疫應(yīng)答主要為病毒株亞型特異性，因此IIV只能引起短期的特異性免疫過程，且對變異產(chǎn)生的新流感病毒無中和作用。

圖3 流感滅活疫苗（IIV）的生產(chǎn)Fig.3 Production of inactivated influenza vaccine（IIV）

與IIV相反，LAIV經(jīng)鼻內(nèi)接種，他們的感染途徑類似于病毒自然感染，誘導(dǎo)了更廣泛、更強大的免疫反應(yīng)，包括黏膜免疫反應(yīng)。更重要的是LAIV 可以在接種人群中引發(fā)特異性T 細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，并對包括流行性流感病毒在內(nèi)的其他病毒株提供交叉保護。與其他流感疫苗相比較，LAIV的保護性是具有明顯優(yōu)勢的［8］。因為抗原漂移會直接影響疫苗效果，因此迫切需要研究出可以中和多個血清型病毒株（包括漂移株和不同亞型病毒株）的疫苗，為流感預(yù)防提供廣泛的交叉保護，LAIV恰恰是在這方面最具優(yōu)勢候選疫苗。

LAIV 由WHO 推薦候選病毒及主供體病毒（master donor virus，MDV）的共同感染雞胚，感染2～3 d 后獲得重配病毒，該病毒包含來自MDV 的6個內(nèi)部片段和來自WHO候選株的HA和NA片段。在針對MDV株表面糖蛋白中和抗體存在的情況下，25 ℃低溫擴增選擇，制備LAIV 疫苗，然后將所選的LAIV 鼻內(nèi)接種（圖4）。這個過程最主要的是要確保所選的MDV減毒、冷適應(yīng)且溫度敏感［9］。MDV在高溫（37 ℃或39 ℃）下復(fù)制能力較弱，較低的溫度（25 ℃至33 ℃）下具有高效的復(fù)制，這種特性使LAIV在較冷的人上呼吸道中有效復(fù)制，同時避免病毒在較熱的下呼吸道中復(fù)制引起疾?。?0］。LAIV 經(jīng)鼻腔內(nèi)接種可能會導(dǎo)致病毒感染人體嗅球，這是一個嚴重的安全隱患；但通過舌下給藥可以克服這一風(fēng)險，同時在防止致死性病毒感染方面同樣有效。

圖4 減毒流感活疫苗（LAIV）的生產(chǎn)Fig.4 Generation of live-attenuated influenza vaccine（LAIV）

傳統(tǒng)上被批準(zhǔn)使用的流感疫苗主要為三價疫苗，包括兩種IAV 亞型（H1N1 和H3N2）和一種乙型流感病毒（IBV）譜系（Victori 型）。但自上世紀70 年代后，兩種乙型流感病毒（IBV）譜系（Victori 型和Yamagata 型）在人類中逐漸流行，F(xiàn)DA 在2012 年批準(zhǔn)包含上述4 種抗原成分的四價疫苗制劑投入使用，四價疫苗可以對流感傳播中2種IBV 譜系以及2種IAV亞型（H1N1和H3N2）有效預(yù)防作用。在四價LAIV 中，2 個冷適應(yīng)MDV 被用作主供體，分別從IAV（H1N1 和H3N2）和IBV（Victori 和Yamagata 型）中利用外部HA 和NA 糖蛋白產(chǎn)生4 種重配病毒［11］。由于尚未完全掌握其減毒機制，目前僅適用于未懷孕的2～49歲健康人群。

以往的研究表明，LAIV 的有效保護率為75%～80%，兒童預(yù)防效果更好，但依舊沒有成為優(yōu)于IIV的推薦使用疫苗。LAIV 在控制流感病毒感染方面的優(yōu)勢在于通過鼻內(nèi)接種方式，可以誘導(dǎo)比IIV 更強大和長期的體液和細胞免疫應(yīng)答，但還需要研究其安全性、有效性、穩(wěn)定性，同時應(yīng)當(dāng)優(yōu)化其產(chǎn)能［12］。

1.3 反向遺傳學(xué)技術(shù)在新型流感疫苗研制中的應(yīng)用 由于流感病毒容易變異，生產(chǎn)出穩(wěn)定和具有交叉保護作用的流感疫苗一直是一項艱巨的挑戰(zhàn)。反向遺傳學(xué)理論使對流感病毒生物學(xué)特性有進一步的闡釋，包括與病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、發(fā)病機制或病毒-宿主相互作用的機制等。反向遺傳學(xué)技術(shù)是通過對病毒基因組加以修飾，從而產(chǎn)生能夠表達外源蛋白的重組病毒作為疫苗載體，可提高LAIV的安全性、免疫原性和保護性，而且產(chǎn)生的重組病毒含報告基因，便于追蹤病毒感染或攜帶，以及預(yù)測其突變及減毒等［13］。

目前，已經(jīng)研制出幾種基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)方法以生產(chǎn)重組流感病毒，最常用的方法是在易感細胞中同時表達陽性鏈病毒mRNA 和陰性鏈病毒vRNA 的8 種雙聯(lián)和雙向質(zhì)粒。這種反向遺傳學(xué)技術(shù)是基于雙重啟動子概念，其中vRNA的cDNA拷貝克隆到攜帶RNA 聚合酶I（Pol I）啟動子的ambisense質(zhì)粒中，以指導(dǎo)vRNA 合成；在相反方向，RNA 聚合酶II（Pol II）啟動子從同一cDNA 驅(qū)動mRNA 表達［14］。然后將8個“雙意義”質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到FDA推薦的細胞中，轉(zhuǎn)染3～4 d，可從轉(zhuǎn)染細胞的組織培養(yǎng)上清液中回收活病毒，然后在FDA 推薦的新鮮細胞或雞胚中擴增培養(yǎng)。

目前用于生產(chǎn)流感病毒疫苗的常用基質(zhì)有雞胚以及哺乳動物細胞如MDCK 或Vero 細胞，Vero 細胞作為基質(zhì)生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎疫苗已有多年的歷史，目前也被批準(zhǔn)用于生產(chǎn)流感疫苗。其優(yōu)點在于其生產(chǎn)原料來源不受限，能有效避免變異的發(fā)生，保護效果好。MDCK 細胞（Madin-Darby canine kidney cells）為犬上皮樣細胞，對大多數(shù)流感病毒敏感，增殖速度快，不易發(fā)生變異。盡管FDA在2012年批準(zhǔn)通過細胞制備流感疫苗的方法，但目前尚不存在利用此種方法制備所需數(shù)量疫苗的設(shè)施，事實上目前大多數(shù)商業(yè)化的流感疫苗都是在雞胚中培養(yǎng)的。與反向遺傳學(xué)方法相比，用雞胚生產(chǎn)流感疫苗可以自然選擇帶有變異的病毒體，這是它在流感疫苗生產(chǎn)過程中的一大優(yōu)勢［15］。但多數(shù)流感病毒在雞胚中生長不佳，影響疫苗制備效率，且雞胚生產(chǎn)時間長、難以自動化、易引起流感病毒變異等缺點，此外禽流感時影響其產(chǎn)量?；诓《举|(zhì)粒的反向遺傳學(xué)方法則有著更快、更好制備流感疫苗的優(yōu)勢。

此外，由于生物安全問題和病毒對雞胚的高殺傷力，傳統(tǒng)的流感疫苗制備方法不能用于生產(chǎn)高致病性流感病毒（highly pathogenic IAV,HPAIV）的疫苗，如H5N1［16］。而反向遺傳學(xué)方法可將H5 或其他HPAIV 減毒，這一優(yōu)點讓流感疫苗研究領(lǐng)域?qū)Υ朔椒ǜ裢飧信d趣。優(yōu)化后的反向遺傳學(xué)方法可以替代傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)方法，有可能成為應(yīng)對流感大流行候選疫苗研發(fā)的首選方法。

2 LAIV研發(fā)的新策略

在過去的幾十年里，LAIVs 研究已取得長足的進步。但疫苗研究和生產(chǎn)仍然是一個緩慢的過程，特別是流感疫苗生產(chǎn)過程中會出現(xiàn)IAV 變異，常導(dǎo)致保護效力低于預(yù)期。因此，迫切需要新的方法來制備LAIV，以提其對高季節(jié)性和大流行性流感的有效性。

2.1 NS1 截短或缺陷病毒的LAIV IAV 非結(jié)構(gòu)性蛋白1（NS1）在受感染的宿主細胞中早期即可表達，

并在病毒的復(fù)制周期中發(fā)揮多種作用。 NS1 是IFN 拮抗劑，可以抑制I-IFN 的產(chǎn)生和抗病毒作用，同時促進病毒復(fù)制，因此有修飾、截短或NS1缺失的IAV 因其拮抗IFN 的能力高度衰減，可作為新型LAIV。有研究對甲型流感進行截短試驗，分為野生型組（A）、NS1 截短組（B）和NS1 缺失組（C），NS1 截短組（B）又分為NS1 1-77、NS1 1-99 和NS1 1-126（數(shù)字范圍表示為氨基酸表達），研究顯示NS1截短或缺失的重組LAIV 可導(dǎo)致病毒在體內(nèi)的衰減，且IFN 的表達與截短的長度有關(guān)（圖5）［18］。此外，在I/ II 期臨床試驗中已證實含有NS1缺陷型的三價疫苗制劑是安全的，且其能夠在健康成人中誘導(dǎo)高水平的抗體［19］。

圖5 基于病毒NS1的截短和/或缺失的LAIVFig.5 LAIV based on truncations and/or deletion of viral NS1

2.2 次優(yōu)密碼子的使用的LAIV 由于遺傳密碼的簡并性，大多數(shù)氨基酸由一種以上的密碼子編碼，被稱為同義密碼子。密碼子使用的偏嗜性是指物種之間和物種內(nèi)部使用同義密碼子的頻率不相等，優(yōu)選密碼子可影響基因表達、蛋白質(zhì)翻譯及蛋白質(zhì)折疊的水平［20］。研究人員利用病毒和宿主對密碼子的偏嗜性，以及新合成修飾病毒基因的新技術(shù)，研發(fā)了在流感病毒蛋白中使用次優(yōu)密碼子來制造新LAIV 的方法。密碼子去優(yōu)化是指使用病毒基因組中錯誤表達的密碼子來產(chǎn)生減毒病毒，通過將數(shù)百個同義突變整合到單個或多個IAV 基因中，可以制備新的LAIV。密碼子偏倚是指某些密碼子對比其他密碼子對出現(xiàn)的頻率更高，并且這種頻率在物種之間有所不同，通過將在宿主遺傳密碼中表現(xiàn)較少的密碼子組合來產(chǎn)生LAIV，并改變參與vRNA 合成和病毒傳播的病毒蛋白表達［21］。NS 片段也可被用于LAIV 的密碼子去優(yōu)化，且其去優(yōu)化程度越高的病毒，其毒力衰減越明顯。使用次優(yōu)密碼子的IAV 必須在體外能有效復(fù)制，這對于疫苗生產(chǎn)很重要；而在體內(nèi)卻要高度減毒，這作為LAIV 的安全性非常重要。因此，LAIV研發(fā)中次優(yōu)密碼子的使用也是研發(fā)安全、有效的LAIV的一種策略。

2.3 病毒基因組重排在LAIVs 發(fā)展中的作用 基因組重排的IAV也可以被用作LAIV制備，與其他方法相比具有以下優(yōu)點：由于基因組的重排，病毒不可能恢復(fù)到有毒力的WT 表型；可以通過改變病毒基因組的結(jié)構(gòu)而不改變蛋白質(zhì)表達來表達外源基因；病毒基因組的重排不影響病毒蛋白的免疫原性；同時表達其他HA 和/或NA 的重排病毒可被制作成二價LAIV 來抵抗多種病毒株。目前，基因組重排技術(shù)已被用于研究針對高致病性IAV（H9N2和H5N1）的LAIV，當(dāng)H9N2-H5 重組病毒作為LAIV 注射到小鼠和雪貂體內(nèi)時，可以有效保護其免受H5N1 和表達了H9 的pH1N1 重組病毒的致命攻擊［22］。這種基因重排技術(shù)與當(dāng)前的疫苗生產(chǎn)是一致的，它可以用于快速生產(chǎn)更有效的LAIV，但需進一步研究這種疫苗的穩(wěn)定性。

2.4 單循環(huán)傳染性IAV 作為LAIV 單循環(huán)傳染性IAV（sciIAV）是利用分子生物學(xué)技術(shù)，使病毒基因組突變、缺失或替換產(chǎn)生的sciIAV。這些病毒可能在病毒基因組合成、病毒組裝或病毒顆粒釋放方面有缺陷，因此在感染后缺乏傳播能力［23］。為了產(chǎn)生和制備sciIAV，需要在容納細胞系中反式提供缺失的基因產(chǎn)物以支持病毒繁殖，而在非容納細胞系中，可發(fā)生原發(fā)性感染，但不會產(chǎn)生感染性病毒顆粒。近幾年中，不同的sciIAV 已被用作包裝信號的研究、中和抗體或抗病毒藥物的篩選、耐藥性、HA 互補、NA 功能分析或疫苗開發(fā)［24］。使用sciIAV 作為LAIV的主要優(yōu)點是可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而病毒不會復(fù)制和導(dǎo)致發(fā)病。但是，一些缺乏流感病毒聚合酶（PB2、PB1 或PA）片段的sciIAV 可能會降低病毒復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄水平，從而影響B(tài) 或T 細胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和保護效果。

產(chǎn)生sciIAV 有以下幾種方法：具有病毒成分缺失或替換的sciIAV，是產(chǎn)生sciIAV最常見的策略，可以是完全或部分缺失病毒成分?；诓《窘M分突變的SciIAV，可導(dǎo)致功能表達或加工喪失，無需刪除或替代完整的病毒基因。HA 切割位點的突變，使HA 不能與唾液酸受體結(jié)合。I AV 離子通道M2蛋白胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的缺乏，導(dǎo)致病毒不能脫殼。

2.5 基于過早終止密碼子的LAIV 最近研制出不具備復(fù)制能力的IAV 活疫苗，是基于過早終止密碼子（PTC）產(chǎn)生的。正常情況下，核糖體與tRNA 互補的三重密碼子將基因組序列翻譯成多肽；而三聯(lián)體UAG（琥珀密碼子）通常是翻譯終止信號或終止密碼子，導(dǎo)致多肽合成的終止。但在某些物種中，UAG 對應(yīng)于tRNA 反密碼子（tRNACUA），它能夠在終止密碼子處引入非天然氨基酸（UAA）。PTC-4 是在IAV 片段PB2、PB1、PA 和NP中含有4個終止密碼子的無復(fù)制能力的PTC 病毒，其特點是在常規(guī)細胞中復(fù)制能力不足，但在含有表達正交tRNA（tRNACUA）的細胞中可有效復(fù)制，因此該技術(shù)作為LAIV 具有很高的安全性。此外，PTC-4 病毒可誘導(dǎo)強大的黏膜、體液和細胞免疫，從而對同源WT 病毒攻擊給予保護［25］?？傊?，這表明基于PTC 技術(shù)的LAIV，可實現(xiàn)對不同亞型IAV株的保護。由于這項技術(shù)相對簡單，它幾乎可以適用于任何可操作病毒。

3 結(jié)束語

疫苗接種仍然是預(yù)防和控制人類和動物流感的首選方法和有效手段，所以需要繼續(xù)評估季節(jié)性流感疫苗的安全性和有效性，以及開發(fā)新的流感疫苗生產(chǎn)技術(shù)。一般來說，LAIV在預(yù)防流感感染方面比IIV 更具優(yōu)勢，但在使用中發(fā)現(xiàn)LAIV 對pH1N1 的保護效果欠佳。盡管LAIV 在2018～2019 年被重新批準(zhǔn)季節(jié)性流感預(yù)防中使用，但四價LAIV 有效性降低仍是一個問題。國家過敏和傳染病研究所（NIAID）與流感研究和監(jiān)測中心（CEIRS）提出，當(dāng)前的首要目標(biāo)就是開發(fā)出通用流感疫苗，這種通用疫苗要求適用于所有年齡段的人群，抗病毒有效性至少達到75%，在至少一年（最好是多個季節(jié)）內(nèi)預(yù)防1 和2 組IAV。此外，通用疫苗還希望擁有類似于LAIV在上呼吸道有效復(fù)制的能力，以誘導(dǎo)更廣泛和持久的免疫應(yīng)答。

反向遺傳學(xué)方法的實施縮短流感疫苗研究到生產(chǎn)所需的時間，極大地促進LAIV 的發(fā)展，更加利于針對大流行性流感病毒的LAIV 的開發(fā)。希望未來的流感疫苗可以增加體液免疫和細胞免疫反應(yīng)，保護相同或不同亞型的IAV，且可在細胞系中批量生產(chǎn)，以進一步縮短生產(chǎn)時間。