王彥坤 馬俊驥

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一種慢性膽汁淤積性肝病，其病因尚不清楚，以免疫介導(dǎo)的膽道損傷和慢性膽汁淤積為特征[1]。肝臟組織標(biāo)本中出現(xiàn)肝內(nèi)膽管損傷及纖維化等改變是PBC病理分期的重要依據(jù)，據(jù)此可以將PBC分為4期[2]。由PBC引起的肝硬化在肝組織病理分期中為第4期，此時(shí)可能會(huì)伴有多種并發(fā)癥，終末期甚至需要肝移植治療。

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種糖蛋白，又稱為分泌型磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1，SPP1)，由人類SPP1基因編碼。SPP1基因位于染色體4的4q13.22位點(diǎn)，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后OPN被選擇性剪接，可以形成OPN-a、OPN-b、OPN-c、OPN-4和OPN-5五種異構(gòu)體，其中OPN-a被認(rèn)為是典型的轉(zhuǎn)錄本[3-5]。Fam20C介導(dǎo)的骨橋蛋白磷酸化是骨橋蛋白分泌的關(guān)鍵，肝硬化患者肝硬度與血清OPN表達(dá)密切相關(guān)[6-7]。研究顯示肝臟炎癥可以通過OPN促成巨噬細(xì)胞活化，OPN參與了內(nèi)源性調(diào)控肝臟攝取過多的脂質(zhì)以保護(hù)肝臟免受脂質(zhì)毒性、細(xì)胞凋亡及相關(guān)的肝纖維化發(fā)生，從而保證肝細(xì)胞的存活，但也可能會(huì)導(dǎo)致分化型肝癌[8-9]。在PBC引起的肝硬化肝組織中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OPN在肉芽腫和損傷的膽管周圍單核細(xì)胞胞質(zhì)為強(qiáng)表達(dá)[10]。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)不同PBC病理分期肝組織OPN的表達(dá)情況，探討OPN在PBC疾病進(jìn)展過程中的作用。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2013年12月至2020年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院70例PBC患者的病理資料。PBC診斷需滿足以下條件中的至少2條：①ALP>150 U/L；②抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody, AMA )陽性，或其他 PBC特異性自身抗體如抗gP210抗體、抗spl00抗體中任意一項(xiàng)呈陽性(血清AMA陰性時(shí))；③肝組織病理檢查提示非化膿性膽管炎和小葉間膽管破壞[2]?；颊吒谓M織病理檢查均簽署知情同意書，研究符合倫理要求。

二、方法

評(píng)估PBC肝臟不同病理分期組織病變和纖維化選用HE、Masson和Gomori銀染方法。CK19、CK7和OPN抗體用來研究PBC肝組織膽管損傷情況和OPN表達(dá)特點(diǎn)，免疫組織化學(xué)染色步驟參照文獻(xiàn)[11-13]。OPN抗體購(gòu)自abcam公司，CK7和CK19免疫組織化學(xué)染色抗體購(gòu)自北京金橋雅圖生物技術(shù)有限公司，OPN、CK7和CK19陽性部位均位于細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)OPN陽性細(xì)胞數(shù)百分比和細(xì)胞平均染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)分[14]。陽性細(xì)胞比例得分：0=無，1=<1%，2=1%～1/10，3=1/10至1/3，4=1/3～2/3，5=>2/3。陽性細(xì)胞平均染色強(qiáng)度得分：0=無，1=弱，2=中，3=強(qiáng)。綜合評(píng)分計(jì)算分析后1～3分的OPN被認(rèn)為是低表達(dá)，4～6分的OPN被認(rèn)為是中度表達(dá)，7～8分的OPN被認(rèn)為是高表達(dá)。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、一般資料

70例患者血清AMA均陽性，其中男性10例，年齡為(53±9)歲，女性60例，年齡為(51±11)歲，男性和女性患者年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.594)。

PBC病理1期患者18例，男性4例，女性14例，年齡(48±12)歲；2期17例，男性3例，女性14例，年齡(48±12)歲；3期18例，男性2例，女性16例，年齡(53±9)歲；4期17例，男性1例，女性16例，年齡(56±7)歲，與1期PBC患者年齡相比，年齡較大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。

二、隨著PBC病程進(jìn)展，肝纖維化和膽管損傷逐漸加重

肝臟穿刺病理標(biāo)本是進(jìn)行PBC病理分期的重要依據(jù)。通過HE、Masson和Gomori銀染方法可以初步判斷匯管區(qū)和肝小葉損傷情況，并評(píng)估肝纖維化進(jìn)展程度(圖1)。PBC病理1期可以看到匯管區(qū)炎癥，部分可見匯管區(qū)肉芽腫，肝小葉基本完整、無明顯纖維化形成。隨著PBC病程進(jìn)展，病理分期會(huì)逐步增加。在病理2期可以看到匯管區(qū)局灶性界板炎以及纖維化組織深入肝實(shí)質(zhì)。在病理3期可以看到明顯的肝纖維化和肝臟膽汁淤積。到第4期可以看到明顯的肝硬化病理改變，以及毛細(xì)膽管膽栓形成。

圖1 采用HE、Masson和Gomori銀染方法判斷匯管區(qū)和肝小葉損傷情況，并評(píng)估肝纖維化進(jìn)展程度(200×)

非化膿性膽管炎和小葉間膽管破壞是PBC典型的病理改變。本研究采用CK7和CK19抗體進(jìn)行肝組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)合評(píng)估導(dǎo)管反應(yīng)(DR)和具有膽管化生傾向的中間肝細(xì)胞，以幫助判斷不同PBC病理分期膽管損傷、肝組織膽汁淤積情況(圖2)。在PBC病理1期肝組織切片匯管區(qū)看到受損的膽管，周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膽汁淤積相對(duì)較輕。在病理2期可以看到匯管區(qū)大量的膽管反應(yīng)性增生的情況發(fā)生，周圍新生肝細(xì)胞。病理3期匯管區(qū)膽管消失情況很常見。在第4期肝硬化階段，匯管區(qū)膽管缺少情況更加嚴(yán)重，周圍大量新生CK7陽性的肝細(xì)胞，同樣提示膽汁淤積很嚴(yán)重。

圖2 肝穿刺組織CK7和CK19免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(400×)

三、在PBC病程進(jìn)展后OPN表達(dá)增多，在不同病理分期存在不一樣的分布特點(diǎn)

免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，OPN在男性患者中的強(qiáng)表達(dá)比率為20.00%，而在女性患者中OPN的強(qiáng)表達(dá)比率為41.67%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.907,P=0.341)，見表1。

表1 肝組織OPN表達(dá)評(píng)分在PBC患者中的性別差異

在1期PBC和2期PBC肝組織，OPN以中度表達(dá)為主，分別為72.22%和76.47%，也存在一部分低表達(dá)病例(分別為11.11%和5.88%)。PBC 1至3期OPN免疫組化評(píng)分強(qiáng)表達(dá)的比率分別為11.11%、17.65%和83.33%；1期和2期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.005,P=0.945)，3期比1期明顯增加(χ2=12.586,P<0.01)，3期比2期也明顯增加(χ2=21.394,P<0.01)。OPN在4期PBC中的強(qiáng)表達(dá)比率為41.18%，中度表達(dá)比率為58.82%。OPN在4期PBC中的強(qiáng)表達(dá)與1期(χ2=0.907,P=0.341)和2期(χ2=0.907,P=0.341)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與3期相比則明顯下降(χ2=4.972,P=0.026)。見表2。

表2 肝組織OPN表達(dá)評(píng)分在PBC不同病理分期中的表達(dá)分布情況

OPN陽性細(xì)胞在1期PBC匯管區(qū)偶爾可以看到。與1期PBC不同，在PBC第2期至第4期肝組織匯管區(qū)中的OPN陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多(圖3)。

圖3 不同病理分期肝組織OPN免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(400X)

采用非參數(shù)Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，PBC病理分期與OPN病理評(píng)分具有一定的相關(guān)性(r=0.396,P=0.001)。

討 論

PBC是導(dǎo)致肝硬化的一個(gè)重要病因，早期以小膽管內(nèi)皮細(xì)胞損傷為主要特征，通過生物化學(xué)指標(biāo)ALP和AMA抗體等可以做出臨床診斷，肝活組織檢查對(duì)于PBC治療應(yīng)答和預(yù)后都有重要指導(dǎo)價(jià)值[2, 11]。OPN在肝硬化發(fā)病過程中具有重要作用[3-4]，但是OPN在PBC不同病理分期中的表達(dá)情況未見詳細(xì)闡述。因此，本研究重點(diǎn)探討了OPN在肝組織的表達(dá)情況與PBC病理分期之間的關(guān)系。

美國(guó)的研究資料顯示，每百萬人口就有293例PBC患者，其中女性PBC患者為每百萬人口428例，男性為每百萬人口107例，女性和男性比例為4∶1[2, 15]。歐洲的流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，每百萬人口就有222.7例PBC患者，其中女性患者為每百萬人口380.7例，男性患者為每百萬人口76.6例，女性和男性比例為5∶1[16]。本研究中PBC女性患者比例很高，OPN強(qiáng)表達(dá)在女性患者的比率為42%，而男性患者OPN強(qiáng)表達(dá)比率為20%，這可能與女性患者在病理分期3和4期中所占比重較大有關(guān)。

OPN作為細(xì)胞連接蛋白，在正常肝臟細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞常規(guī)低表達(dá)[3, 10]。本研究中在1期PBC病理分期中3例患者肝組織OPN呈低表達(dá)狀態(tài)，2期中有1例患者肝組織OPN呈低表達(dá)狀態(tài)，但是在PBC病理分期3期和4期患者，肝組織中未見OPN低表達(dá)狀態(tài)。對(duì)肝組織OPN高表達(dá)病例進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著病理分期從1期進(jìn)展至3期的過程中，OPN高表達(dá)比例逐漸增高，提示OPN高表達(dá)與PBC進(jìn)展過程密切相關(guān)。PBC病理分期第3期也稱為肝纖維化期，OPN高表達(dá)比例在第3期最高，說明OPN可能與肝組織纖維化相關(guān)。盡管在第4期無OPN低表達(dá)狀態(tài)患者，但是OPN高表達(dá)比例與第3期相比較低，這可能與肝硬化期PBC肝組織再生能力下降有關(guān)系。

本研究采用CK7和CK19來標(biāo)記膽管細(xì)胞，可以區(qū)分正常膽管結(jié)構(gòu)、肝組織再生過程中反應(yīng)性增生的膽管細(xì)胞和具有雙向分化潛能的部分肝細(xì)胞[11-12]。PBC病理1期匯管區(qū)膽管消失很少見，常見的是膽管細(xì)胞損傷，并伴隨周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)形成肉芽腫，因此在PBC病理1期肝組織偶爾可以O(shè)PN陽性表達(dá)的巨噬細(xì)胞，而在匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞表達(dá)以低表達(dá)或者中度表達(dá)為主。PBC病理2期匯管區(qū)導(dǎo)管反應(yīng)常見，損傷的膽管細(xì)胞周圍明顯肉芽腫，常伴隨界面性肝炎，CK7陽性肝細(xì)胞增多，在PBC病理2期擴(kuò)大的匯管區(qū)?？梢钥吹絆PN陽性表達(dá)的巨噬細(xì)胞。PBC病理3期匯管區(qū)膽管缺失常見，膽汁淤積加重，Masson染色和Gomori銀染可以看到來自匯管區(qū)大量纖維組織延伸至肝小葉內(nèi)，匯管區(qū)內(nèi)可見大量OPN陽性表達(dá)的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞OPN通常高表達(dá)。在PBC病理4期成纖維細(xì)胞明顯增多，形成巨大的纖維瘢痕分割肝組織，形成假小葉，OPN陽性表達(dá)的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞所占比率與第3期相比有所下降，毛細(xì)膽管中可見膽栓形成。通過OPN在PBC病理4個(gè)分期匯管區(qū)的表達(dá)分布特點(diǎn)分析可以發(fā)現(xiàn)，OPN高表達(dá)與引起膽管細(xì)胞免疫損傷的炎癥細(xì)胞有關(guān)，同時(shí)也與肝組織損傷修復(fù)過程中的再生肝細(xì)胞有關(guān)。

綜上所述，PBC發(fā)展到肝纖維化后，OPN在肝組織中的表達(dá)量明顯增加，肝硬化后OPN高表達(dá)比率降低。OPN高表達(dá)提示膽管免疫損傷負(fù)荷加重，同時(shí)也預(yù)示肝組織增生能力較強(qiáng)。OPN與PBC病理分期密切結(jié)合對(duì)于病情嚴(yán)重程度評(píng)估及患者預(yù)后預(yù)測(cè)有重要的臨床價(jià)值。