張琪 王余彥 秦波

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一個(gè)全球性問題[1]。肝內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)是導(dǎo)致HBV感染慢性化的主要原因[2]。而肝內(nèi)cccDNA的清除被認(rèn)為是慢性乙型肝炎(CHB)完全治愈[3-4]。但無論是核苷類似物NAs還是干擾素IFN均無法直接作用于肝內(nèi)cccDNA，因而完全治愈幾乎無法實(shí)現(xiàn)。目前各種指南及專家共識(shí)多將功能性治愈暨臨床治愈[4-7]作為CHB治療的理想終點(diǎn)，而未對(duì)肝內(nèi)cccDNA水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。肝內(nèi)cccDNA的存在，使得這些經(jīng)過長期抗病毒治療、甚至是實(shí)現(xiàn)了功能性治愈的患者，停藥后仍面臨著復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

肝內(nèi)cccDNA水平的測(cè)定需進(jìn)行有創(chuàng)性肝穿刺，臨床上難以普及。因而，亟待找尋一種可反映肝內(nèi)cccDNA水平的無創(chuàng)性新型血清學(xué)標(biāo)志物。血清HBV RNA就是近年研究的熱點(diǎn)之一[8]。已有學(xué)者證實(shí)血清HBV RNA實(shí)際上是由前基因組RNA(pregenomic RNA, pgRNA)及其剪切變異體形成的病毒樣顆?；蛞職た贵w復(fù)合物[9-11]。PgRNA由肝內(nèi)cccDNA直接轉(zhuǎn)錄形成，因而血清HBV RNA在反映肝內(nèi)cccDNA存在及活性方面都具有優(yōu)勢(shì)[12-14]。

最近，一些研究[15-20]開始關(guān)注停藥時(shí)血清HBV RNA狀態(tài)與停藥后復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。本meta分析將探討停藥時(shí)血清HBV RNA狀態(tài)與停藥后復(fù)發(fā)情況之間的內(nèi)在聯(lián)系，為今后尋找指導(dǎo)安全停藥的新型血清學(xué)標(biāo)志物提供依據(jù)。

資料與方法

一、 文獻(xiàn)檢索

檢索PubMed、Embase、Web of science、Cochrane library以及網(wǎng)站https://clinicaltrials.gov/，搜集2016至2020年期間發(fā)表的關(guān)于血清HBV RNA與CHB患者停藥后復(fù)發(fā)之間關(guān)系的相關(guān)英文文獻(xiàn)。檢索詞為血清HBV RNA和CHB的英文(具體如下: “HBV RNA” or “HBV pgRNA” or “HBV pregenomic RNA” or “hepatitis B virus RNA” or “hepatitis B virus pgRNA” or “hepatitis B virus pregenomic RNA”和“hepatitis B, chronic” or “chronic hepatitis B” or “chronic hepatitis B virus Infection” or “hepatitis B virus infection,chronic”)。同時(shí)進(jìn)行手工檢索。以PubMed為例，具體檢索策略見圖1。本研究在注冊(cè)前進(jìn)行了預(yù)檢索，相關(guān)中文研究數(shù)量少，以綜述為主，基本無符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)；因而著重檢索了英文文獻(xiàn)。(PROSPERO網(wǎng)站注冊(cè)號(hào): CRD42020208267)。

二、 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

(一) 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)研究對(duì)象為長期接受抗病毒治療并停藥的CHB患者；(2)文章提供所需數(shù)據(jù)；(3)隊(duì)列研究；(4)英文文獻(xiàn)。

(二) 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)研究對(duì)象不符合前述條件；(2)文章無法提供所需數(shù)據(jù)；(3)非隊(duì)列研究；(4)其他語種文獻(xiàn)，重復(fù)文獻(xiàn)，不能進(jìn)行meta分析的文獻(xiàn)。

三、 文獻(xiàn)篩選與數(shù)據(jù)提取

嚴(yán)格按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行文獻(xiàn)篩選。對(duì)于最終納入本meta分析的文獻(xiàn)，研究者將提取以下信息：(1)作者、發(fā)表年份、國家及研究類型；(2) 目標(biāo)人群基本特征(包括人數(shù)、患者基本情況)；(3)停藥時(shí)血清HBV RNA狀態(tài)、隨訪時(shí)間、停藥后復(fù)發(fā)情況；(4)血清HBV RNA檢測(cè)為陰性的標(biāo)準(zhǔn)、具體的停藥標(biāo)準(zhǔn)及復(fù)發(fā)的定義。兩位研究者分別獨(dú)立進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，出現(xiàn)任何分歧都將進(jìn)行討論后達(dá)成共識(shí)或者通過咨詢第三位研究者來解決。

四、 結(jié)局指標(biāo) 分析所有納入文獻(xiàn)的特點(diǎn)，由于文獻(xiàn)的描述廣泛，故大致考慮復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)臨床復(fù)發(fā)：停藥后出現(xiàn)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)異常升高；(2) 病毒學(xué)復(fù)發(fā)：停藥后血清HBV DNA水平異常升高。并從最終納入的文獻(xiàn)中提煉出復(fù)發(fā)的具體定義。

五、 納入文獻(xiàn)的質(zhì)量評(píng)價(jià) 由于納入的研究均為隊(duì)列研究，因而使用紐卡斯?fàn)栦滋A量表(NOS)23來評(píng)估每項(xiàng)研究的質(zhì)量。大于6分為高質(zhì)量文獻(xiàn)。

六、 統(tǒng)計(jì)分析 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用Revman 5.3軟件進(jìn)行。通過計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比(RR)和95%CI來確定停藥時(shí)血清HBV RNA狀態(tài)與停藥后復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。總效應(yīng)采用Z檢驗(yàn)，如果P<0.05，則認(rèn)為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。緊接著將進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，如果存在顯著的異質(zhì)性(I2>50%)，使用隨機(jī)效應(yīng)模型；如果異質(zhì)性較小(I2<50%)則采用固定效應(yīng)模型。為了探尋導(dǎo)致異質(zhì)性的潛在原因，將對(duì)存在顯著異質(zhì)的研究進(jìn)行亞組分析。最后進(jìn)行敏感性分析評(píng)估此次meta分析的結(jié)果是否穩(wěn)健可靠。若有10項(xiàng)以上的研究納入本meta分析，將使用漏斗圖來評(píng)估發(fā)表偏倚。

結(jié) 果

一、 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

初步檢索共得到599篇文獻(xiàn)，其中Web of science檢索到159篇文獻(xiàn)，Pubmed檢索到104篇文獻(xiàn)，Embase檢索到240篇文獻(xiàn)， Cochrane library檢索到91篇文獻(xiàn)，Clinical trials共檢索到13個(gè)相關(guān)研究，但均未提供相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果或處于研究未完成狀態(tài)，因而未納入；同時(shí)手工檢索到5篇文獻(xiàn)。首先排除267篇重復(fù)文獻(xiàn)，然后通過閱讀標(biāo)題和摘要排除314篇文獻(xiàn)，最后通過閱讀全文排除14篇文獻(xiàn)。最后，來自4篇文章[17-20]的6項(xiàng)獨(dú)立研究被納入本次meta分析，為了區(qū)分來自同一篇文章的不同研究，采用”作者名字1”和”作者名字2”來區(qū)分。所有納入研究均為隊(duì)列研究，在2016年至2020年間以英文發(fā)表。具體文獻(xiàn)篩選流程如圖1所示。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

二、納入文獻(xiàn)基本特征及質(zhì)量評(píng)價(jià)

表1總結(jié)了最終納入研究的特點(diǎn)及NOS評(píng)分。

表1 文獻(xiàn)基本特征及質(zhì)量評(píng)價(jià)表

三、meta分析結(jié)果

(一) 臨床復(fù)發(fā)情況 來自3篇文章中的4項(xiàng)研究[16-18]報(bào)道了停藥后的臨床復(fù)發(fā)情況。根據(jù)患者停藥時(shí)HBV RNA狀態(tài)，將患者分為HBV RNA陽性組和HBV RNA陰性組。其中HBV RNA陽性組共133例患者，有49例患者在停藥后出現(xiàn)了臨床復(fù)發(fā)；而HBV RNA陰性組71例患者中僅有8例在停藥后出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)。研究之間的異質(zhì)性較小(Chi2=3.41,P=0.33,I2=12%)，因而采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析。meta分析結(jié)果顯示，停藥時(shí)血清HBV RNA陽性患者在停藥后出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)更高(RR=2.98, 95%CI=1.55～5.72,P=0.001，圖2)。

圖2 臨床復(fù)發(fā)情況

(二) 病毒學(xué)復(fù)發(fā)情況 來自4篇文章的6項(xiàng)研究[15-18]報(bào)告了停藥后的病毒學(xué)復(fù)發(fā)情況。此項(xiàng)分析共納入256例患者，其中HBV RNA陽性患者156例，HBV RNA陰性患者100例。研究之間存在顯著的異質(zhì)性(Chi2=34.11,P<0.01,I2=85%)，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，相比于血清HBV RNA陽性患者，血清HBV RNA陰性患者停藥后病毒學(xué)復(fù)發(fā)率較低(39%, 39/100 vs 67.3%, 105/156,P=0.07，見圖3)，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 病毒學(xué)復(fù)發(fā)情況

(三) 異質(zhì)性檢驗(yàn) 為探討報(bào)道病毒學(xué)復(fù)發(fā)的研究之間異質(zhì)性的可能原因，對(duì)以下四個(gè)方面進(jìn)行亞組分析，包括樣本人數(shù)、隨訪時(shí)間、血清HBV RNA檢測(cè)為陰性的標(biāo)準(zhǔn)、病毒學(xué)復(fù)發(fā)的定義。亞組分析的結(jié)果顯示，小樣本數(shù)量(樣本人數(shù)<30Chi2=9.44,P=0.009,I2=79% vs樣本人數(shù)>30Chi2=2.27,P=0.32,I2=12%))和病毒學(xué)復(fù)發(fā)定義的不同(HBV DNA>20 iu/mLChi2=25.03,P<0.01,I2=92% vs HBV DNA>2000 IU/mLChi2=1.05,P=0.31，I2=5%)可能是造成研究間顯著異質(zhì)性的原因。而隨訪時(shí)間的不同(隨訪時(shí)間<3年Chi2=25.03，P<0.01，I2=92% vs隨訪時(shí)間>3年Chi2=11.79，P=0.003，I2=83%)、血清HBV RNA檢測(cè)為陰性的標(biāo)準(zhǔn)不一致(HBVR RNA低于LLOQChi2=10.52，P=0.001，I2=90% vs HBV RNA 檢測(cè)不到Chi2=17.89，P=0.0005，I2=83%)不能解釋異質(zhì)性。

(四) 敏感性分析 采用逐一排除文獻(xiàn)法。在本meta分析中，排除任何一項(xiàng)研究都不會(huì)過度影響異質(zhì)性，因而考慮本次meta分析結(jié)果相對(duì)穩(wěn)健。但對(duì)于報(bào)道臨床復(fù)發(fā)的4項(xiàng)研究[18-20](所有納入研究之間異質(zhì)性較小I2=12%)，必須提到的是，在排除Ivana1 2020這項(xiàng)研究之后，異質(zhì)性(P=0.94,I2=0%)消失了。進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)，該研究對(duì)于臨床復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)的定義較其他研究更具包容性，即ALT>10 ULN(檢測(cè)上限)時(shí)才認(rèn)為臨床復(fù)發(fā)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于多種指南中常用的ALT水平。但總的來說，敏感性分析顯示了本次meta分析結(jié)果的穩(wěn)定性。

(五) 發(fā)表偏倚 由于在本meta分析中只有不到10項(xiàng)研究，使用漏斗圖來評(píng)估發(fā)表偏倚是非常受限的，因而未采用漏斗圖評(píng)估發(fā)表偏倚。但本次meta分析的發(fā)表偏倚是可以合理推斷的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)納入的研究都是在2020年發(fā)表的，且未對(duì)灰色文獻(xiàn)進(jìn)行專門的檢索。

討 論

肝內(nèi)cccDNA的持續(xù)存在使CHB患者停藥后仍面臨復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。臨床工作中，肝內(nèi)cccDNA的監(jiān)測(cè)因有創(chuàng)性肝活檢而受限。血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA有良好的相關(guān)性，在一定程度上可以反映肝內(nèi)cccDNA的存在。因而本meta分析探討了停藥時(shí)血清HBV RNA狀態(tài)與停藥后復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。

本meta分析結(jié)果顯示，停藥時(shí)血清HBV RNA陽性的患者停藥后出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)更高(RR=2.98, 95%CI=1.55～5.72,P=0.001)。研究間異質(zhì)性較小，采用固定效應(yīng)模型。敏感性分析表明，雖然存在一定的異質(zhì)性，但結(jié)果是穩(wěn)健可靠的。同時(shí)，本meta分析發(fā)現(xiàn)，相比于HBV RNA陽性患者，停藥時(shí)血清HBV RNA陰性患者病毒學(xué)復(fù)發(fā)率較低(39% vs 67.3%,P=0.07)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究表明，停藥后病毒學(xué)復(fù)發(fā)情況的研究間存在顯著的異質(zhì)性，因而研究者進(jìn)行了亞組分析，結(jié)果表明產(chǎn)生異質(zhì)性的主要原因是樣本數(shù)量和病毒學(xué)復(fù)發(fā)定義的不同。

抗病毒藥物如NAs或IFNs不能清除肝內(nèi)cccDNA。所以即使達(dá)到了理想的治療終點(diǎn)——功能性治愈之后再停止治療，患者也有可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)。這一點(diǎn)在本meta分析中得到了部分證實(shí)，那些在停藥時(shí)血清HBV RNA為陽性的患者，或者換句話說，其cccDNA仍處于激活狀態(tài)的患者在停藥后更有可能出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)。另一方面，停藥時(shí)血清HBV RNA陰性的患者病毒學(xué)復(fù)發(fā)率確實(shí)更低，但在本meta分析中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)論看起來似乎與臨床實(shí)踐不符。因此研究者進(jìn)一步行亞組分析以探討原因。結(jié)果表明，樣本量和病毒學(xué)定義的不同可能是造成這些研究之間顯著異質(zhì)性的原因。

綜上，血清HBV RNA對(duì)于預(yù)測(cè)CHB患者停藥后復(fù)發(fā)有重要意義。本meta分析首次系統(tǒng)探討了血清HBV RNA在預(yù)測(cè)CHB患者停藥后復(fù)發(fā)方面的意義，為進(jìn)一步尋找安全停藥的新指標(biāo)提供了依據(jù)。但本meta分析仍然有一些局限性。首先，納入本次meta分析中的研究是非常有限的，灰色文獻(xiàn)沒有被專門搜索，這可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)表偏倚，影響結(jié)果的穩(wěn)定性。第二，結(jié)局指標(biāo)的定義和停藥的標(biāo)準(zhǔn)雖然相似，但并不完全一致，盡管研究者已經(jīng)進(jìn)行了亞組分析以減少由此引起的異質(zhì)性。第三，目前相關(guān)研究總體較少，此次meta分析研究總量少于10例，可能造成研究的局限性。

綜上所述，血清HBV RNA是協(xié)助預(yù)測(cè)停藥后臨床復(fù)發(fā)的重要生物標(biāo)志物。未來還需進(jìn)一步深入研究。