周艷艷

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)患者常見合并肝硬化類型為原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)，此類患者病情發(fā)展迅速，預(yù)后較差[1]。有研究發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)性T細胞或Th17平衡失調(diào)可能參與其異常自身免疫過程[2-4]。但是關(guān)于原發(fā)性膽汁性肝硬化合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血T細胞亞群及Th1、Th2和Th17細胞因子表達是否存在差異尚無明確定論。本研究選取我院60例PBC合并SLE患者作為研究對象，探討其外周血T細胞分化比例及其臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

選取解放軍聯(lián)勤保障部隊天津康復(fù)療養(yǎng)中心(原第四六四醫(yī)院)2018年1月至2021年1月收治的60例PBC合并SLE患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合PBC合并SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)(既往有SLE病史，主要表現(xiàn)為肺動脈高壓、血紅細胞減少、腎炎，且首次確診為肝硬化)[5]；治療前未經(jīng)過可能對研究結(jié)果產(chǎn)生影響的藥物治療；年齡≥18歲；對本研究知情并簽署同意書。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝細胞癌者；合并細菌或真菌感染者；嚴(yán)重重要器官功能障礙者；合并全身炎癥疾病者。

另選取60名同期來我院體檢的健康者作為對照組。病例組患者中男性29例，女性41例；年齡為20～46，平均(38.84±2.58)歲；臨床表現(xiàn)為肝性腦病2例、食管胃底靜脈曲張5例、肝脾腫大7例、腹水13例、凝血異常14例，血紅細胞減少19例。對照組患者中男性17例，女性43例。年齡為18～52，平均(38.95±2.83)歲。兩組性別、年齡對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

二、方法

對所有患者進行T淋巴細胞亞群檢測，PCR測定，血清Th1類、Th2類、Th17類細胞因子分泌檢測。

(一) T淋巴細胞亞群檢測 抽取所有受檢者的空腹肘靜脈血液標(biāo)本2 mL，分別加入乙二胺四乙酸二鉀進行抗凝處理，并在樣品測定管之中加入抗凝血50 μL，之后加入20 μL單抗，震蕩混勻后，在室溫下避光孵育20 min，再加入溶血素2 mL，震蕩混勻，室溫下避光防止10 min。應(yīng)用1 500 r/min速度離心5 min后，放棄上層清液，加入500 μL PBS 應(yīng)用流式細胞儀與BD FACSuite軟件獲取熒光參數(shù)，并檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD16+、CD56+、Treg、CD4+/CD8+表達水平。

(二)PCR測定 抽取所有受檢者外周血4 mL，應(yīng)用密度梯度離心分析，得到單個核細胞，應(yīng)用PBS液洗滌兩次，應(yīng)用10%小牛血清與雙抗RPMI1640和培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細胞濃度，賦予培養(yǎng)1 h之后，收集懸浮細胞，并應(yīng)用尼龍柱法得到T淋巴細胞。TNF-α上游引物：5′-GCTTCTGCATTTGAGTTTGCTAGC-3′，下游引物：5′-CGAACACTTTGAATATTTCTTTAT-TAAG-3′、IL-2上游引物：5′-GAATGGAATTAAT-AAATTACAAGAATCCC-3′，下游引物：5′-TGTT-TCAGATCCTTTAGTTCCAG-3′；IL-4上游引物：5′-GGGTCTCACCCAACTGCT-3′，下游引物：5′-CGAACACTTGAATATTTCTTTCTCTCTAT-D′、IL-6上游引物：5′-GACCAAAGCCAGAGTCCTTC-AGAGAGATACAG-3′，下游引物：5′-TTGGATG-TCTTGGTCCTTAGCCAC-3′、IL-10上游引物： 5′-AACATACTGCTAACCGACTC-3′，下游引物：5′-ATGCTCCTTGATTTCTGG-3′、IL-17A上游引物：5′-CAGTGCCAGCCTCTGCTCAT-3′，下游引物：5′-ATACTCAGCACCAGCACAR-3′、IL-22上游引物：5′-CCAAGTGCTGCCGGTCATTTTC-3′，下游引物：5′-GGCTCGAGGGATGATTTCAA-3′。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，主循環(huán)40次。并將收獲的細胞在液氮下研磨，依照試劑盒說明書進行RNA提取操作，RNA含量、完整性與濃度檢測與上述步驟相同。在20 g/L瓊脂凝膠中電泳紫外燈下拍照，并將底片應(yīng)用激光密度掃描。分別對每一個目的基因β-actin的吸光度(A)值進行測量，并取IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22 mRNA與β-actin吸光度比值作為相對含量。

(三)血清Th1類、Th2類、Th17類細胞因子分泌檢測 抽取空腹靜脈血3 mL，放置到真空試管內(nèi)，待凝固后，應(yīng)用3 000 r/min的離心速度在常溫下離心5 min，留取上層清液。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測Th1類(IFN-γ、TNF-α、IL-2)、Th2(IL-4、IL-6、IL-10)類、Th17類(IL-17A、IL-22)細胞因子分泌水平，所有檢測流程均依照試劑盒說明書嚴(yán)格進行。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采取統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 23.0對本研究數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料以例數(shù)/百分比(n/%)表示，進行χ2檢驗；計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、外周血T淋巴細胞亞群表達對比

病例組CD3+、CD4+、CD8+、CD16+、CD56+、Treg和CD4+/CD8+比值明顯低于對照組，CD8+高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 外周血T淋巴細胞亞群表達對比

二、相關(guān)炎癥細胞因子mRNA表達對比

病例組IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22 mRNA表達高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 相關(guān)炎癥細胞因子mRNA表達對比

三、血清中Th1類、Th2類、Th17類細胞因子分泌

病例組Th1類(IFN-γ、TNF-α、IL-2)、Th2(IL-4、IL-6、IL-10)類、Th17類(IL-17A、IL-22)細胞因子分泌水平明顯高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 血清中Th1類、Th2類、Th17類細胞因子分泌(±s)

討 論

T淋巴細胞按照功能可分為細胞毒性T細胞、輔助性T細胞、異質(zhì)性T細胞等亞群，按照表面標(biāo)志可分為CD4+和CD8+兩大亞群[6-7]。而Th細胞又可成為CD4+細胞，可分為Th2和Th1兩個種類，通過主要組織相容性復(fù)合體(MHC Ⅱ)激活后分泌細胞因子，協(xié)調(diào)或調(diào)解免疫反應(yīng)[8]。毒性或抑制T細胞又可成為CD8+細胞，通過MHCI與抗原結(jié)合直接作用在靶細胞上[9-10]。目前公認的PBC合并SLE發(fā)病機制主要為環(huán)境誘因、免疫耐受機制失衡、遺傳易感性等多因素過程[11]。在常規(guī)分子水平上，PBC合并SLE發(fā)病被認為是MHC Ⅱ與抗原和T細胞受體，由于免疫耐受缺乏導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細胞逃避正常抑制，導(dǎo)致肝臟壞死，引發(fā)炎癥發(fā)展[12]。多項研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，PBC合并SLE屬于糖皮質(zhì)激素療法干預(yù)有效的慢性肝病，但是并不意味著治療終止，在停藥之后會出現(xiàn)病情反復(fù)發(fā)作現(xiàn)象。過去，雖然特定生物制劑在炎癥疾病的治療過程中有了巨大進展，但是PBC合并SLE的診療依然是人類面臨的一項巨大挑戰(zhàn)。吳志敏等[15]研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性肝病患者外周血活化的Tfh細胞數(shù)量增加，且活化Tfh細胞數(shù)目和外周血中免疫球蛋白水平呈正相關(guān)。目前關(guān)于外周血T細胞亞群在自PBC合并SLE發(fā)病中的作用機制研究較少。

本研究結(jié)果顯示，病例組CD3+、CD4+、CD8+、CD16+、CD56+、Treg和CD4+/CD8+比值明顯低于對照組，CD8+高于對照組(P<0.05)。已有大量研究證實[16]，諸多疾病中外周血單個核細胞中CD4+/CD8+和CD4+及NK細胞活性或CD16+、CD56+淋巴細胞下降。以往研究對于HBV感染患者單個核細胞中CD4+與CD8+亞群研究發(fā)現(xiàn)，CD4+/CD8+和CD4+水平下降，CD8+水平上升與病毒復(fù)制狀態(tài)和肝內(nèi)炎癥具有明顯相關(guān)性，與本研究結(jié)果相符[17]。這可能是因為我們所使用的外周血實驗單抗與其淋巴亞群識別特異性相關(guān)，也有可能是CD4+細胞亞群組分多樣性相關(guān)。CD4+T細胞之中除了非特異性免疫抑制細胞(Ts)之外，還有自然殺傷性細胞(CD4+CD56+)。Ts屬于激活型T細胞亞群，其表面標(biāo)志為CD4+CD25+CD45RO+，會受到自分泌TGFβ1誘導(dǎo)后自激，通過包膜接觸對于CD8+CTL與抗原提呈細胞等發(fā)揮出免疫抑制作用，進而導(dǎo)致機體出現(xiàn)炎癥抑制與免疫耐受現(xiàn)象；病例組IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22 mRNA表達高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；病例組Th1類(IFN-γ、TNF-α、IL-2)、Th2(IL-4、IL-6、IL-10)類、Th17類(IL-17A、IL-22)細胞因子分泌水平明顯高于對照組(P<0.05)。由此證明，PBC合并SLE患者體內(nèi)炎性因子明顯升高。作為肝病主要差異性細胞群，CD4+細胞又可分為Th1與Th2兩種，Th1細胞主要產(chǎn)生TNF-α、TNF-β、IFN-γ、IL-2等，增強了細胞的免疫應(yīng)答。而Th2細胞主要產(chǎn)生IL-10、IL-6、IL-5以及IL-4等，輔助B淋巴細胞分化成抗體產(chǎn)生細胞，多與體液免疫相關(guān)。而Th1或Th2類的因子分泌和其相互之間的平衡在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)和多種疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[18]。而Th17細胞異位其分泌IL-17而被命名。轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β和IL-6共存情況下，TGF-β會誘導(dǎo)Th17細胞的大量形成。而一旦缺乏IL-6，單獨的TGF-β并不能誘導(dǎo)Th17細胞分化，由此可以看出IL-6和TGF-β屬于啟動Th17細胞分化的必要因素。Th17細胞分泌可產(chǎn)生IL-6、IL-22、IL-21、IL-17F、IL-17A等，并通過這些細胞因子發(fā)揮出其特有的相關(guān)功能，從而參與移植排斥、自身免疫性疾病、腫瘤、感染以及宿主防御等病理過程[19]。其中IL-17是Th17細胞主要的效應(yīng)因子，屬于重要的炎性介質(zhì)，可誘導(dǎo)TNF-α、IL-6以及基質(zhì)金屬蛋白酶表達，進而引發(fā)組織損傷與炎癥細胞浸潤。Th17在許多器官特異性免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)活檢中均可發(fā)現(xiàn)IL-17的存在。另有動物實驗表明[20]，肝組織微環(huán)境更有利于Th17細胞發(fā)育分化，因此Th17可能參與PBC合并SLE的發(fā)生，與本研究結(jié)果相符。

綜上所述，PBC合并SLE患者外周血T淋巴細胞亞群比例明顯降低，提示患者有免疫功能下降，且PBC合并SLE患者會合并明顯炎癥反應(yīng)升高現(xiàn)象。但本研究依然存在一定局限，并沒有研究所有Th1、Th2和Th17細胞的相關(guān)因子類型，因此還需在后續(xù)研究中增加樣本量進行深入研究。