于學(xué)文 孫立新 馬聚珂 李小芹 尹義強(qiáng) 劉善鳳 鞏若箴

下咽癌及喉癌是頭頸部惡性腫瘤之一，其中大 部分為鱗狀細(xì)胞癌，因其發(fā)病位置隱蔽，早期患者癥狀不明顯，且易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，患者確診時常為晚期，預(yù)后極差[1]。近年來學(xué)者研究表明，在腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移及凋亡過程中Ki-67 抗原發(fā)揮著重要作用，Ki-67 表達(dá)水平高低反應(yīng)著腫瘤細(xì)胞的分化程度、浸潤轉(zhuǎn)移能力，目前Ki-67 抗原已被廣泛應(yīng)用于測定多種惡性腫瘤增殖活性的重要指標(biāo)[2-4]，Ki-67 表達(dá)陽性率越高，腫瘤細(xì)胞處于增殖周期的細(xì)胞越多，腫瘤增殖越快，其侵襲性越強(qiáng)[5-7]。由于下咽癌及喉癌患者不同臨床分期，影響其治療方案的選擇及預(yù)后情況[1，8]。本研究旨在探討下咽癌及喉癌中Ki-67 表達(dá)情況與腫瘤分期（TNM）的相關(guān)性，為下咽癌及喉癌患者個體化、精準(zhǔn)化治療及預(yù)后提供支持。

資料與方法

1 一般資料

以2019 年2～12 月在本院收治的35 例下咽癌及喉癌患者為研究對象，患者均為男性，年齡46～79歲，平均（61.7±7.6）歲。下咽癌患者臨床癥狀多表現(xiàn)為吞咽異物感及梗塞感、吞咽疼痛，伴有進(jìn)行性吞咽困難；喉癌患者臨床癥狀多表現(xiàn)為聲嘶、呼吸困難等；患者發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時可出現(xiàn)頸部包塊。本研究制定納入標(biāo)準(zhǔn)為：①所有下咽癌及喉癌患者均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)；②所有下咽癌及喉癌患者均有腫瘤分期；③所有下咽癌及喉癌患者均檢測Ki-67 表達(dá)情況；④所納入患者均未進(jìn)行放化療等相關(guān)治療；⑤排除由其他腫瘤侵犯或轉(zhuǎn)移。

2 Ki-67 表達(dá)情況評判標(biāo)準(zhǔn)

HE 染色：蠟塊以4μm 的厚度進(jìn)行連續(xù)切片，放入60℃恒溫箱中烤片2h，以防脫片。切片浸入二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，蘇木素染色5min，水洗后1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍(lán)，0.5%伊紅染色1min，常規(guī)脫水、透明、封片。

免疫組化染色：采用EnVision 兩步法。常規(guī)組織石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；經(jīng)EDTA（pH8.0）緩沖液高壓鍋煮沸1min 進(jìn)行抗原修復(fù)處理，冷卻至室溫，PBS 沖洗；3%H2O2室溫下孵育10min，PBS 沖洗；滴加Ki-67 單克隆抗體后置于37℃恒溫箱中孵育60min，PBS 沖洗；滴加抗小鼠/兔IgG 過氧化物酶聚合物，室溫孵育30min；滴加新鮮配制的DAB 顯色液，室溫孵育5～10min；蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。

由2 位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片。免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（Streptavidinperosidase, SP），當(dāng)腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)出現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒時判定為Ki-67 表達(dá)陽性。每張切片通過光鏡選擇10 個典型高倍視野（×400），每個視野計(jì)數(shù)100 個細(xì)胞，計(jì)算各視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)百分比的平均值百分率作為Ki-67 表達(dá)指數(shù)。

陽性細(xì)胞百分率（N）分為4 個等級：“N=0”為陰性（-），“0＜N≤25%”為弱陽性（+），“25%＜N≤50%”為中度陽性（++），“50%＜N≤75%”為高度陽性（+++），“N＞75%為強(qiáng)陽性（++++）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究利用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析，并對有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者進(jìn)行受試者操作特征曲線（ROC）分析，評估其預(yù)測效能，確定診斷閾值，并計(jì)算曲線下面積、敏感度、特異度。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入35 例下咽癌及喉癌患者，其中下咽癌患者23 例，喉癌12 例，根據(jù)腫瘤TNM 分期（T 指原發(fā)腫瘤范圍，N 指區(qū)域淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及范圍，M 指遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是否存在）：T1期1 例，T2期10 例，T3期13 例，T4期11 例；N0期11例，N1期2 例，N2期10 例，N3期12 例；所納入研究患者均為M0期。

Ki-67 表達(dá)百分率與腫瘤TNM 分期中T 分期無明顯相關(guān)性（P=0.600）；Ki-67 表達(dá)等級與腫瘤TNM 分期中T 分期無明顯相關(guān)性（P=0.958）。Ki-67表達(dá)指數(shù)與腫瘤TNM 分期中N 分期存在相關(guān)性（P=0.017），相關(guān)系數(shù)為r=0.402；Ki-67 表達(dá)指數(shù)≥0.6 時，區(qū)域淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移靈敏度及特異度分別為60%、90%，ROC 曲線下面積0.75（0.58～0.93）（圖1）。Ki-67 表達(dá)等級與TNM 分期中N 分期存在相關(guān)性（P=0.004），相關(guān)系數(shù)為r=0.478；Ki-67 表達(dá)等級≥3 級時，區(qū)域淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移靈敏度及特異度分別為60%、80%，ROC 曲線下面積0.72（0.54 ～0.85）（圖2）。

圖1 Ki-67 表達(dá)指數(shù)預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC

圖2 Ki-67 表達(dá)等級預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC

討論

惡性腫瘤增殖活性與細(xì)胞調(diào)亡及細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制密切相關(guān)，完整的細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖過程與其調(diào)控表達(dá)明顯相關(guān)。細(xì)胞不可控性增殖、分裂是腫瘤惡性程度的重要依據(jù)，Ki-67 增殖抗原可以敏感反應(yīng)細(xì)胞增殖活性，研究顯示腫瘤惡性度隨著Ki-67 增殖抗原表達(dá)指數(shù)的增高而增高，因此，Ki-67 增殖抗原表達(dá)水平的檢測對于腫瘤生物活性的評估至關(guān)重要[9]。

Ki-67 是核增殖抗原，Ki-67 增殖抗原在細(xì)胞處于靜止和休眠期并不表達(dá)。近年來，學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Ki-67 增殖抗原在喉癌及下咽癌中高表達(dá)[3，4，9，10]，我們的研究顯示Ki-67 增殖抗原在喉癌及下咽癌中過度表達(dá)，35 例下咽癌及喉癌病人中29 例(82.9%)高表達(dá)。雖然Ki-67 增殖抗原在細(xì)胞分裂過程中的確切機(jī)制未明，但是它的表達(dá)與細(xì)胞的增殖具有一致性，若是陽性則表明細(xì)胞增殖活躍。

本研究采用免疫組化染色法檢測下咽癌及喉癌組織中Ki-67 增殖抗原的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Ki-67增殖抗原的陽性表達(dá)主要位于下咽癌及喉癌組織細(xì)胞核內(nèi)，呈現(xiàn)為棕黃色顆粒，正常組織中沒有發(fā)現(xiàn)Ki-67 增殖抗原表達(dá)。目前Ki-67 表達(dá)水平與腫瘤臨床病理分期的研究結(jié)果不一致，仍存在一定爭議。Vukelic 等[11]認(rèn)為Ki-67 表達(dá)水平與腫瘤組織學(xué)分級呈顯著正相關(guān)，Ki-67 表達(dá)與腫瘤的診斷、分期及治療結(jié)果無關(guān)，Ki-67 在喉癌中的表達(dá)不是準(zhǔn)確診斷和預(yù)測臨床病程的最可靠指標(biāo)。鐘偉銘等[12]認(rèn)為Ki-67 表達(dá)在鼻咽癌中高表達(dá)，但是Ki-67 表達(dá)水平與鼻咽癌的臨床分期無關(guān)。楊萍麗等[13]認(rèn)為Ki-67 表達(dá)水平與鼻咽癌的臨床分期、腫瘤組織學(xué)分級相關(guān)，Ki-67 表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，P27表達(dá)與Ki-67 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，CyclinD1 表達(dá)與Ki-67 表達(dá)呈正相關(guān)。郭珍珍等[14]認(rèn)為Ki-67 表達(dá)水平與喉癌患者2 年內(nèi)復(fù)發(fā)、無病、生存期的長短及腫瘤臨床分期均不相關(guān)。本研究經(jīng)Spearman 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Ki-67 增殖抗原表達(dá)與下咽癌及喉癌患者腫瘤TNM 分期中T 分期無關(guān)，與腫瘤TNM 分期中N 分期具有顯著相關(guān)性，而且Ki-67 表達(dá)水平越高，提示腫瘤越易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果與Sarafoleanu 等[15]研究結(jié)果基本一致。

目前關(guān)于Ki-67 增殖抗原表達(dá)對惡性腫瘤的作用及其導(dǎo)致腫瘤的機(jī)制尚未研究清楚，其是否與其他功能蛋白互相作用共同影響腫瘤的惡性程度需深入研究。但是本研究表明Ki-67 增殖抗原在下咽癌及喉癌組織中明顯高水平表達(dá)，且在下咽鱗癌組織中Ki-67 增殖抗原表達(dá)水平與頸部區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)，可作為下咽癌及喉癌患者淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的相關(guān)指標(biāo)，Ki-67 陽性高表達(dá)患者可能有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，手術(shù)及放療時要注意對頸部淋巴結(jié)的處理。Ki-67 表達(dá)與惡性程度呈正比，腫瘤組織分化程度與惡性程度理論上也是相關(guān)的，本研究與既往研究的結(jié)果不一致的原因可能在于研究對象、患者確診時間、腫瘤生長時間、樣本量大小等的不同。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在下咽癌及喉癌中Ki-67 表達(dá)水平與腫瘤TNM 分期中N 分期存在顯著相關(guān)性，且Ki-67 表達(dá)水平越高，腫瘤越易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，為下咽癌及喉癌患者個體化、精準(zhǔn)化治療及預(yù)后提供理論支持。然而，影響下咽癌及喉癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因素及機(jī)制非常復(fù)雜，在下咽癌及喉癌中Ki-67 表達(dá)水平對臨床診斷、治療及預(yù)后的價值，還需進(jìn)行多中心、大樣本量的研究進(jìn)一步探究。