劉 嘉，嚴寶飛，孫占東，張?zhí)煊?，曾慶琪,3

(1.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床學(xué)院，江蘇 南京 210046；3.江蘇省中醫(yī)院 男科，江蘇 南京 210029)

痛經(jīng)為最常見的婦科癥狀之一，主要表現(xiàn)為月經(jīng)期痙攣性疼痛，嚴重者可因疼痛而暈厥。痛經(jīng)分為原發(fā)性痛經(jīng)和繼發(fā)性痛經(jīng)，其中原發(fā)性痛經(jīng)占患者人數(shù)的一半以上[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為：原發(fā)性痛經(jīng)主要為子宮收縮不良，進而導(dǎo)致子宮缺血、缺氧，經(jīng)血流出不暢，同時可能伴隨前列腺素(PG)、血管加壓素(AVP)、催產(chǎn)素(OT)、鈣離子(Ca2+)等分泌異常[2]，最終表現(xiàn)為經(jīng)期或經(jīng)期前后小腹疼痛等癥狀?，F(xiàn)代西醫(yī)治療包括藥物治療和手術(shù)治療，其中又以藥物治療為主。中醫(yī)謂痛經(jīng)為：“經(jīng)行腹痛，證有虛實，實者或因寒滯，或因血滯，或因熱滯，虛者或因血虛，或因氣虛”，認為痛經(jīng)病機主要為氣血運行不暢導(dǎo)致的“不通則痛”，胞宮失卻濡養(yǎng)導(dǎo)致“不榮則痛”[3]。與西藥治療相比，中藥不僅能達到止痛之效，更能發(fā)揮中醫(yī)辨證論治，起到標本兼顧的效果[4]，故研究與開發(fā)防治原發(fā)性痛經(jīng)的中藥具有重要意義。

當歸為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，其味甘辛，溫通而和血活血、行瘀消腫、調(diào)經(jīng)止痛；紅花為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，味辛，善走心肝二經(jīng)，入血能活血通經(jīng)、祛瘀止痛。二者合用則具有補血活血、祛瘀通絡(luò)以及痛經(jīng)止痛之功效，被應(yīng)用于《傷寒大白》之當歸紅花湯，《麻科活人》之當歸紅花飲，《醫(yī)宗金鑒》之桃紅四物湯，《醫(yī)林改錯》之血府逐瘀湯等[5]，已為中醫(yī)婦科常用藥對?，F(xiàn)代臨床將其用于血瘀或血虛之痛經(jīng)、閉經(jīng)和月經(jīng)不調(diào)等癥[6]。

中藥及其組方往往含有多種類型的化學(xué)成分，且成分之間互相影響，共同作用于多個途徑、多個環(huán)節(jié)和靶點，最終形成獨特的中醫(yī)臨床功效。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合分子生物學(xué)、藥理學(xué)等多種學(xué)科的網(wǎng)絡(luò)平臺，通過構(gòu)建藥物—成分—靶點—疾病的整體網(wǎng)絡(luò)，全面系統(tǒng)地反映中藥及其組方治療疾病的作用機制，從而契合祖國醫(yī)學(xué)的整體治療觀[7]。盡管已有文獻報道桃紅四物湯、四物湯治療原發(fā)性痛經(jīng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，但尚無當歸-紅花藥對治療原發(fā)性痛經(jīng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)報道。與以往文獻相比，本研究以當歸-紅花藥對為切入點，擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討當歸-紅花藥對治療原發(fā)性痛經(jīng)的潛在活性成分和可能的作用機制，并揭示其配伍的科學(xué)內(nèi)涵。通過對當歸-紅花藥對治療原發(fā)性痛經(jīng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，不僅有助于解析當歸-紅花藥對在桃花四物湯、補陽還五湯等中藥復(fù)方中的作用，更有利于指導(dǎo)其臨床科學(xué)用藥，提高臨床治療效果，對于揭示含當歸-紅花藥對復(fù)方制劑的配伍理論有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 當歸-紅花藥對中目標化學(xué)成分的選取

以課題組前期對當歸、紅花功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，結(jié)合國內(nèi)外關(guān)于當歸、紅花藥效及質(zhì)量控制相關(guān)文獻，選取當歸、紅花中25個化學(xué)成分為研究對象，詳見表1。

表1 當歸-紅花中25個化學(xué)成分的信息Table 1 Information of 25 compounds in ASR-CF

1.2 化學(xué)成分作用靶點的獲取

將以上25個化學(xué)成分的名稱作為關(guān)鍵詞導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫(http:∥tcmspw.com/tcmsp.php中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺)、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)、BindingDB數(shù)據(jù)庫(http:∥www.bindingdb.org/)、PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http:∥www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http:∥bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，獲得當歸-紅花上述成分的作用靶點。同時比對UniPort數(shù)據(jù)庫(https:∥uniport.org/)，選擇作用靶點的標準名稱，并建立目標成分的潛在作用靶點庫。

1.3 原發(fā)性痛經(jīng)靶點的篩選

將primary dysmenorrhea、primary dysmenorrheal和essential dysmenorrhea作為關(guān)鍵詞導(dǎo)入GeneCards數(shù)據(jù)庫(http:∥www.genecards.org/)、NCBI數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)、TTD數(shù)據(jù)庫(http:∥db.idrblab.net/ttd/)、CTD數(shù)據(jù)庫(http:∥ctdbase.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https:∥omim.org/)中，其中NCBI中設(shè)置物種為Homo sapiens，以檢索原發(fā)性痛經(jīng)疾病相關(guān)靶點基因。將當歸-紅花中目標成分潛在作用靶點與原發(fā)性痛經(jīng)靶點基因?qū)隫enny 2.1繪圖軟件中取交集，獲取當歸-紅花化學(xué)成分潛在的治療原發(fā)性痛經(jīng)的靶點。

1.4 藥物—成分—靶點—疾病整體網(wǎng)絡(luò)的建立

利用Cytoscape 3.7.0軟件對當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)潛在靶點信息進行可視化處理，建立藥物—成分—靶點—疾病整體網(wǎng)絡(luò)，并進行拓撲學(xué)分析。其中，成分和靶點在網(wǎng)絡(luò)中以“節(jié)點”表示，成分與靶點之間的聯(lián)系以“邊”表示。

1.5 當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的建立

使用STRING數(shù)據(jù)庫(https:∥string-db.org/)獲取當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)潛在靶點之間的相互作用關(guān)系，并利用Cytoscape 3.7.0軟件對上述關(guān)系進行可視化處理及網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析。

1.6 當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)潛在靶點的生物功能注釋(GO)和KEGG通路富集分析

將當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)潛在靶點導(dǎo)入R語言(https:∥www.r-project.org/)中的Bioconductor生物信息軟件包(DOSE[10]、clusterProfiler[11]、pathview[12]，http:∥www.bioconductor.org/)進行GO和KEGG通路富集分析。設(shè)置P<0.05為分析范圍，獲取當歸-紅花與原發(fā)性痛經(jīng)潛在關(guān)聯(lián)關(guān)系與作用機制的生物功能注釋及主要作用通路，隨后設(shè)置基因富集數(shù)量及P值為過濾條件，對排名前20的生物學(xué)功能和通路進行可視化處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)的潛在靶點預(yù)測

當歸-紅花中24個化學(xué)成分(羥基紅花黃色素A暫無作用靶點)在TCMSP、SwissTargetPrediction、BindingDB、PharmMapper和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的作用靶點去除重復(fù)，共獲得487個作用靶點。GeneCards、NCBI、TTD、CTD和OMIM數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)原發(fā)性痛經(jīng)的相關(guān)基因去除重復(fù)共775個靶點基因。24個化學(xué)成分和原發(fā)性痛經(jīng)靶點基因進行映射，獲得81個當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)潛在靶點，結(jié)果見圖1和表2。

表2 當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)的潛在靶點Table 2 Potential targets of ASR-CF in the treatment of primary dysmenorrhea

圖1 作用靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of targets

2.2 藥物—成分—靶點—疾病整體網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

藥物—成分—靶點—疾病整體網(wǎng)絡(luò)結(jié)果見圖2。由圖2可知：該網(wǎng)絡(luò)共有107個節(jié)點，441條邊，最外圈為當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)潛在靶點，內(nèi)圈為化學(xué)成分。節(jié)點越大，其度值越大，即該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要，故槲皮素、山奈酚、熊果酸、野黃芩素、咖啡酸、七葉亭、阿魏酸、東莨菪內(nèi)酯、阿魏酸松柏酯和蘆丁等成分和PTGS2、CA2、PTGS1、AKR1B1、CA3、ESR2、ALOX5、TTR、MMP2和EGFR等靶點在整體網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，提示這些節(jié)點是當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)的核心成分和靶點。

圖2 藥物—成分—靶點—疾病整體網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Drug-compound components-targets-disease network

槲皮素可通過影響體內(nèi)花生四烯酸代謝途徑從上游抑制地諾前列酮(PGE2)和環(huán)氧合酶2(COX-2)的合成[11]，其中PGE2的升高是導(dǎo)致痛經(jīng)的主要機制，COX-2亦可催化生成PGE2，故槲皮素可通過抑制PGE2和COX-2的水平治療原發(fā)性痛經(jīng)。山奈酚可激活雌激素受體活性[12]，雌激素與受體結(jié)合可激活血清肥大細胞釋放致痛物質(zhì)，進一步導(dǎo)致痛經(jīng)的發(fā)生，因此山奈酚可通過調(diào)節(jié)雌激素受體活性影響痛經(jīng)進程。熊果酸能上調(diào)一氧化氮合酶(NOS)、NO水平[13]，NO可使局部血管舒張、平滑肌細胞舒張以及抑制血小板聚集，進而減輕痛經(jīng)癥狀[14]，NOS是NO在體內(nèi)的唯一限速酶，故熊果酸可通過上調(diào)NOS、NO水平減輕痛經(jīng)癥狀。咖啡酸可抑制多種炎性介質(zhì)的合成與釋放，有效控制神經(jīng)元氧化損傷，獲得鎮(zhèn)痛作用[15]。蘆丁可阻止Ca2+內(nèi)流并降低組織細胞Ca2+超載，亦能控制內(nèi)皮素的變化和降低NO的異常增高[16]，細胞內(nèi)Ca2+超載可引起子宮頸攣縮，導(dǎo)致痛經(jīng)，內(nèi)皮素與其受體結(jié)合后，促進子宮平滑肌和血管的收縮加速疼痛進程[2]，故蘆丁通過阻止Ca2+內(nèi)流、控制內(nèi)皮素和NO水平干預(yù)痛經(jīng)過程。綜上，提示當歸-紅花中多種化學(xué)成分可通過多種機制發(fā)揮治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用。

PTGS2、PTGS1又分別稱COX-2、環(huán)氧合酶1(COX-1)，是花生四烯酸合成各種內(nèi)源性前列腺素(PGs)過程中的限速酶，參與調(diào)節(jié)子宮肌細胞的收縮和舒張。PTGS1還是阿司匹林、布洛芬等臨床常用治療痛經(jīng)的非甾體抗炎藥的作用靶標，故PTGS2、PTGS1與痛經(jīng)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17]。AKR1B1可激活NF-κB，抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖，影響血管重塑[18]，如孫基豐等[19]證明其可參與血管炎、血管狹窄等多種存在氧化應(yīng)激效應(yīng)的心血管疾病。ESR2是一種雌激素受體，介導(dǎo)雌激素的基因型效應(yīng)，雌激素可促進月經(jīng)前期PGF2α的產(chǎn)生，參與痛經(jīng)的發(fā)生發(fā)展[20]。ALOX5可催化機體生產(chǎn)花生四烯酸，進而生成不同類型的前列腺素，從而調(diào)節(jié)子宮肌細胞的收縮和舒張[21]。MMP2是一種Ca2+依賴性蛋白酶，可參與機體的炎癥反應(yīng)及缺血、缺氧損傷等[22]。表皮生長因子受體EGFR與機體平滑肌痙攣和中樞鎮(zhèn)痛相關(guān)[1]。綜上可見，當歸-紅花可通過作用于PTGS2、PTGS1、AKR1B1、ESR2、ALOX5、MMP2、EGFR等靶點干預(yù)痛經(jīng)的發(fā)生發(fā)展。

2.3 當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果

當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果見圖3。由圖3可知：該網(wǎng)絡(luò)包含81個節(jié)點和1 048條邊。節(jié)點越大表明節(jié)點度值越大，即該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。ALB、INS、AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、EGFR、PTGS2、ESR1等度值顯著高于其余靶點，在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著橋梁作用，可能是當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)的關(guān)鍵作用靶點。

圖3 當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of primary dysmenorrhea targets of ASR-CF

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用構(gòu)成了細胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的一個主要組成部分，對調(diào)控細胞及其信號有重要意義。PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點與炎癥、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白有IL-6、VEGFA、PTGS2和TNF，與激素水平調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白有PTGS2、EGFR和ESR1，與中樞鎮(zhèn)痛相關(guān)的蛋白有ALB、EGFR，與平滑肌痙攣相關(guān)的蛋白有VEGFA。IL-6是一種在免疫細胞和非免疫細胞中均具有多種功能的炎性細胞因子，可介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致子宮平滑肌缺血，產(chǎn)生缺氧疼痛，是導(dǎo)致痛經(jīng)的一個潛在機制[23]。TNF是一種具有多種生物活性的多肽細胞因子，可激活細胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)誘發(fā)炎性反應(yīng)及鈣平衡的改變，導(dǎo)致血管功能紊亂、血管損傷和誘發(fā)血栓形成[24]。VEGFA的主要功能為促進血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移生長，增加微血管通透性，加速血管生長，參與維持正常的月經(jīng)周期，亦與雌激素水平和黃體形成具有較高的相關(guān)性[25]。黃體中期雌激素水平高峰可促進PGF2α生成，引發(fā)痛經(jīng)。ESR1亦為一種雌激素受體，可以與雌激素發(fā)生特異性結(jié)合而形成二聚體，使激素發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，從而對痛經(jīng)過程產(chǎn)生影響[26]。故IL-6、TNF、VEGFA和ESR1等靶點可能是當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)的關(guān)鍵作用靶點。槲皮素、山奈酚、熊果酸、野黃芩素、咖啡酸和七葉亭等主要化學(xué)成分通過作用于這些關(guān)鍵靶點而發(fā)揮治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用。例如，槲皮素同時作用于IL-6、TNF和VEGFA；山奈酚同時作用于TNF和IL6；熊果酸和咖啡酸同時作用于ESR和TNF；野黃芩素作用于VEGFA。綜上，這些化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點形成緊密的互作網(wǎng)絡(luò)，以“多成分、多靶點”模式共同作用于原發(fā)性痛經(jīng)的治療。

2.4 GO功能注釋分析結(jié)果

GO功能注釋共獲得364個條目(P<0.05)，其中生物過程(BP)條目231個，細胞組成(CC)條目29個，分子功能(MF)條目104個。根據(jù)P<0.01，分別取排名前10的條目制作條形圖，GO可視化結(jié)果見圖4，同一顏色區(qū)域自左向右P值越大。由圖4可知：當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)生物過程涉及對類固醇激素的反應(yīng)，激素代謝過程，類固醇代謝過程，活性氧代謝過程，活性氧代謝過程的調(diào)控，細胞激素代謝過程以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面；細胞組成涉及囊腔，分泌顆粒腔，胞質(zhì)小泡腔，血小板α顆粒管腔和血小板α顆粒等方面；分子功能主要集中于氧結(jié)合，類固醇羥化酶，血紅素結(jié)合，鐵離子結(jié)合，氧化還原酶活性和單加氧酶活性等方面。

圖4 GO功能注釋分析結(jié)果Fig.4 GO enrichment analysis of the key targets

2.5 KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集共獲得132個條目(P<0.05)，具有顯著意義的有119個條目(P<0.01)，剔除與疾病不相關(guān)的通路，篩選共得到27條與原發(fā)性痛經(jīng)相關(guān)的通路，結(jié)果見表3。由表3可知：27條通路與激素調(diào)節(jié)相關(guān)通路有9條，分別是甾體激素生物合成，卵巢甾體生成，催乳素信號通路，雌激素信號通路，甲狀腺激素信號通路，生長激素的合成、分泌和作用，孕酮介導(dǎo)的卵母細胞成熟，催產(chǎn)素信號通路以及甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用。與中樞鎮(zhèn)痛相關(guān)通路有2條：FcεRI信號通路，氮代謝。與平滑肌解痙相關(guān)通路有3條：ErbB信號通路，血管內(nèi)皮生長因子信號通路和PPAR信號通路；與炎癥相關(guān)通路有9條：PI3K/AKT信號通路，IL-17信號通路，MAPK信號通路，JAK/STAT信號通路，血管內(nèi)皮生長因子信號通路，Th17細胞分化，花生四烯酸代謝，NF-κB信號通路和NOD樣受體信號通路。與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)通路有5條：Toll樣受體信號通路，T細胞受體信號通路，5-羥色胺能突觸，趨化因子信號通路和B細胞受體信號通路。以上結(jié)果表明：當歸-紅花可通過激素調(diào)節(jié)、中樞鎮(zhèn)痛、平滑肌解痙以及免疫調(diào)節(jié)等各個通路發(fā)揮作用，達到治療原發(fā)性痛經(jīng)的效果。

表3 KEGG通路富集分析結(jié)果Table 3 KEGG pathway enrichment analysis of the key targets

本研究對潛在作用靶點的通路注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當歸-紅花可通過炎癥，平滑肌解痙，中樞鎮(zhèn)痛及激素水平調(diào)節(jié)通路治療原發(fā)性痛經(jīng)，亦能通過Toll樣受體、T細胞受體等免疫調(diào)節(jié)信號通路，故當歸-紅花可能會通過增強機體免疫功能，協(xié)同抗炎、平滑肌解痙、中樞鎮(zhèn)痛對原發(fā)性痛經(jīng)產(chǎn)生全面的治療作用。

3 結(jié)論

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)的化學(xué)成分、作用靶點和通路等作用機制進行了系統(tǒng)分析，從分子水平初步闡述了當歸-紅花中槲皮素、山奈酚、熊果酸、野黃芩素、咖啡酸、七葉亭、阿魏酸、東莨菪內(nèi)酯、阿魏酸松柏酯和蘆丁等24個成分，可能通過與炎癥、激素調(diào)節(jié)、中樞鎮(zhèn)痛、平滑肌解痙以及免疫相關(guān)的27條通路，干預(yù)PTGS2、CA2、PTGS1、AKR1B1、CA3、ESR2、ALOX5、TTR、MMP2、EGFR等81個靶點，從而發(fā)揮治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用。

方中成分或作用于多個靶點、通路，或多個成分共同作用于同一個靶點、通路。各類成分既有共同的作用靶點群及通路群，又各有倚重，各通路群間通過共有靶點連接，顯示出不同成分間的多靶點協(xié)同作用，充分體現(xiàn)了中醫(yī)藥在治療疾病的多成分、多靶點和多途徑整合調(diào)節(jié)的作用特點。研究結(jié)果可為當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用機制提供一定的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)，為后續(xù)深入驗證當歸-紅花治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用機制奠定一定的基礎(chǔ)，也為中醫(yī)藥防治疾病的多維度、多層次研究提供了新的思路。