趙云環(huán)，趙 強，劉 瑩，張 帥，郭 禹，左玉柱，2*，范京惠，2* (.河北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河北 保定 0700； 2.河北省獸醫(yī)生物技術創(chuàng)新中心，河北 保定 0700)

豬圓環(huán)病毒 2 型 (porcine circovirus type 2，PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、皮炎和腎病綜合征(porcine dermatitis nephropathy syndrome，PNDS)及豬圓環(huán)病毒相關疾病(porcine circovirus associated diseases,PCVAD)的主要病原體[1]，也被認為是目前影響全球養(yǎng)豬業(yè)的最古老且最普遍的病原體。PCV2感染豬后，主要存在豬的腹股溝淋巴結、扁桃體、胸腺等免疫器官，以淋巴組織的細胞凋亡為特征，使宿主產(chǎn)生嚴重的免疫抑制效應[2]。此外，該病還可導致感染豬群發(fā)生持續(xù)性感染，使得疫病長期存在，難以根除[3]，是困擾養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一大難題。

PCV2是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員，是已知感染哺乳動物的最小病毒。PCV2基因組為單股、封閉、環(huán)狀DNA，大小為 1 766,1 768或1 777 nt，預測具有11個重疊開放閱讀框(ORF)。根據(jù) FRANZO等[4]描述的 PCV2 毒株更新的系統(tǒng)發(fā)育基因型定義，PCV2可分為8種基因型(PCV2a～PCV2h)。PCV2的ORF2基因編碼的Cap蛋白存在較多抗原表位區(qū)，加速了PCV2的變異速率，因此，ORF2基因常常作為PCV2遺傳變異分析的標記基因。

由于PCV2的遺傳變異速率較快，自2000年PCV2首次在我國報道以來[5]，在我國廣泛流行，且保持著快速進化的趨勢，當前的疫苗不能夠提供全面的保護。因此，進一步探究當前PCV2流行株的遺傳變異特性，從而為制備有效的PCV2疫苗提供適宜的疫苗株，對PCV2的防控具有重要理論意義。本研究對本實驗室獲得的8株PCV2進行分離鑒定及遺傳進化分析，解析其遺傳變異規(guī)律及流行特性，為本地區(qū)PCV2的預防、治療及疫苗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑PK-15細胞株、鼠源PCV2多抗由本實驗室保存；DNA/RNA提取試劑盒購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司；瓊脂糖凝膠DNA/RNA回收試劑盒購自杭州倍沃醫(yī)學科技有限公司；DL2000 DNA Marker購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；4%細胞固定液、BSA購自北京索萊寶科技有限公司；FITC標記羊抗小鼠IgG (H+L)抗體購自Affinity公司。

1.2 病料采集及處理32份疑似PCV2組織采集自河北省衡水、保定、邢臺、石家莊、滄州、唐山6個不同地區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)殖廠。將采集的組織充分剪碎，加入適量生理鹽水于研磨器研磨呈勻漿狀，轉移至離心管，8 000 r/min離心5 min,取上清液儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計根據(jù)GenBank中已登錄的PCV2、PRV和CSFV分離株的基因序列，應用Primer Premier 5.0軟件分別設計病毒檢測的特異性引物以及PCV2 Cap全基因引物(表1)，由生工生物工程(上海)有限公司合成，使用濃度為10 μmol/L。

表1 引物序列及相關信息

1.4 核酸提取及檢測將本實驗室收集的來自河北省不同地區(qū)的32份疑似PCV2陽性組織分別按照真瑞生物病毒DNA/RNA提取試劑盒和TRIzol使用說明提取總DNA和總RNA，利用本實驗室已有的檢測方法進行PCV2、PRV、CSFV的檢測。

1.5 PCV2全基因擴增與測序以鑒定為PCV2陽性的樣品DNA為模板，使用PCV2C-R/F全基因引物，參照文獻[6]進行全基因擴增，將PCV2陽性樣品中擴增出的清晰特異的產(chǎn)物條帶進行純化后送生工生物工程(上海)有限公司進行序列測定。

1.6 病毒分離與鑒定

1.6.1病毒分離 將1.4中篩選出的僅PCV2陽性且序列測定正確的病料懸液進行10倍稀釋后無菌接種至單層生長的PK-15細胞，同時以未接種PCV2病料懸液的細胞作對照組。每天觀察細胞狀態(tài)，直至出現(xiàn)大量細胞脫落。將細胞液進行3次反復凍融后收集病毒液并于-80℃保存?zhèn)溆?，同時接種PK-15細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)。分別將收集的第1，5，10代病毒液(F1，F(xiàn)5，F(xiàn)10)進行DNA提取，并通過實驗室已建立的方法進行PCV2 的PCR特異性擴增。

1.6.2間接免疫熒光鑒定 將PK-15細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞生長至40%左右，試驗組每孔加入100 μL1.6.1收集的F10細胞病毒液，對照組每孔加入等量PBS液，37℃吸附90 min，加入100 μL含1%青鏈霉素的細胞培養(yǎng)液，24 h后用4%細胞固定液室溫固定15 min；0.2% Triton X-100室溫通透10 min；PBS清洗2次，使用5%牛血清白蛋白(BSA)，37℃封閉1 h；PBS清洗3次，每次5 min，按100 μL/well加入鼠源PCV2多抗(5% BSA的PBS作稀釋液，1∶100稀釋)，37℃孵育2 h；PBS清洗4～5次，每次5 min，按100 μL/well加入FITC-羊抗鼠IgG熒光抗體(5% BSA作稀釋液，1∶200稀釋)，37℃孵育45 min；PBS清洗3次，50%甘油封片后，在倒置熒光顯微鏡下觀察試驗結果。

1.6.3透射電鏡觀察 取1.6.1收集的F10細胞病毒液，4℃ 5 000 r/min 離心20 min去除細胞碎片，收集上清進行冷凍超速離心，棄去上清，用ddH2O重懸沉淀，經(jīng)磷鎢酸負染色后，通過JEM-1400透射電鏡觀察病毒粒子形態(tài)。

1.7 PCV2遺傳進化分析選取國內(nèi)外已發(fā)布的PCV2 疫苗毒株、各基因型標準參考毒株、國內(nèi)外不同國家和地區(qū)毒株作為參考，分別用DNAStar的MegAlign程序和MEGA 10.0軟件對測序正確的全基因組及分離毒株的全基因序列和ORF2基因序列進行核苷酸同源性比對并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，同時對ORF2基因編碼的Cap蛋白氨基酸同源性和突變位點進行分析。

2 結果

2.1 樣品篩選及PCV2全基因擴增使用檢測引物對本實驗室收集的來自河北省不同地區(qū)的32份疑似PCV2感染的組織進行初步檢測，結果顯示，其中1份組織僅感染PCV2，12份組織為PCV2和PRV和/或CSFV共感染，PCV2陽性率為40.63%。部分檢測結果見圖1。對檢測為PCV2陽性的組織進行PCV2全基因擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，共9份組織擴增出1 790 bp的預期片段(圖2)。對PCV2全基因擴增產(chǎn)物純化后進行測序，用DNAStar的SeqMan程序?qū)y序結果進行拼接，最終獲得8株全基因序列，分別命名為CH/HB/CZ01、CH/HB/CZ02、CH/HB/XJ01、CH/HB/HS01、CH/HB/HD01、CH/HB/HD02、CH/HB/HD03、CH/HB/XT01。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2～14.32份疑似組織部分檢測結果圖1 PCV2檢測結果

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2～13.PCV2全基因擴增結果圖2 PCV2全基因擴增結果

2.2 分離毒株生物學鑒定將篩選出的僅有PCV2 CH/HB/XT01株感染的組織進行研磨，制備組織懸液，過濾除菌后接種PK-15細胞，盲傳10代后進行生物學鑒定。

2.2.1分離毒株PCR特異性鑒定 以收集的CH/HB/XT01株的F1，F(xiàn)5，F(xiàn)10細胞病毒液提取的DNA為模板，使用PCV2 F/R進行特異性擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，PCV2 F/R擴增出1條大小為400 bp左右的電泳條帶，與預期片段(422 bp)大小相符(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2.F10病毒液；3.F5病毒液；4.F1病毒液圖3 分離毒株PCR鑒定結果

2.2.2間接免疫熒光鑒定 通過間接免疫熒光試驗檢測CH/HB/XT01株F10細胞病毒液，以實驗室保存的鼠源PCV2多抗分別處理感染F10細胞病毒液的PK-15細胞和經(jīng)PBS處理的對照組PK-15細胞。熒光顯微鏡下觀察到F10細胞病毒液感染的PK-15細胞胞漿內(nèi)有典型的特異性亮綠色熒光(圖4B)，而PBS處理的對照組PK-15細胞則未見特異性亮綠色熒光(圖4A)。

A.陰性對照；B.CH/HB/XT01 F10細胞病毒液感染的PK-15細胞圖4 間接免疫熒光鑒定(200×)

2.2.3透射電鏡觀察 將收集的CH/HB/XT01株F10細胞病毒液通過超高速離心及磷鎢酸負染處理后，透射電鏡下可觀察到球形，邊緣清晰，無囊膜，直徑約為20 nm的病毒粒子(圖5)。

圖5 病毒粒子透射電鏡觀察結果

2.3 分離毒株全基因遺傳進化分析將獲得的8株PCV2全基因組序列與GenBank中登錄的45株PCV2全基因通過MegAlign的Clustal W方法進行核苷酸同源性比對，結果顯示獲得的8株PCV2全基因序列之間同源性為95.0%～99.8%，與參考序列比對同源性為94.6%～99.0%。使用MEGA 10.0軟件采用鄰比法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖6)，結果顯示獲得的8株PCV2全基因序列分屬于PCV2a、PCV2b和PCV2d分支，其中CH/HB/XT01株同中國山西株SXJX(GenBank登錄號：MH922991)處于PCV2a同一分支；CH/HB/CZ01、CH/HB/CZ02、CH/HB/XJ01與朝鮮毒株A4099(GenBank登錄號：JF317566)親緣關系較近，同屬于PCV2b分支；CH/HB/HS01、CH/HB/HD01、CH/HB/HD02、CH/HB/HD03與中國吉林株PCV2/NM/NM2/2016(GenBank登錄號：MT-302499)同屬于PCV2d分支。

紅色字體為本研究毒株圖6 PCV2全基因系統(tǒng)進化樹

2.4 分離毒株ORF2遺傳進化分析獲得的8株PCV2 ORF2基因全長均為702 bp，編碼233個氨基酸，通過MegAlign的Clustal W方法進行核苷酸同源性比對，結果顯示分離的8株PCV2 ORF2基因組序列之間同源性為94%～100%，與GenBank中登錄的52株PCV2 OFR2基因參考序列之間同源性為83.5%～99.6%。使用MEGA 10.0軟件采用鄰比法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖7)，結果顯示CH/HB/XT01株屬于PCV2a分支，同中國山西SXJX株、上海BJ0901a株、北京GX0601株、江蘇FJ株親緣關系較近；CH/HB/CZ01、CH/HB/CZ02和CH/HB/XJ01與朝鮮毒株A4099親緣關系較近，同屬于PCV2b分支；CH/HB/HS01、CH/HB/HD01、CH/HB/HD02和CH/HB/HD03均屬于PCV2d分支，其中CH/HB/HS01與中國吉林株PCV2/JL/JL98/2018親緣關系較近，CH/HB/HD01、CH/HB/HD02和CH/HB/HD03與朝鮮株SNUVR201901親緣關系較近。

紅色字體為本研究毒株圖7 PCV2 ORF2基因系統(tǒng)進化樹

2.5 分離株ORF2遺傳變異分析應用DNAStar軟件的MegAlign程序?qū)Λ@得的8株PCV2 ORF2基因編碼的Cap蛋白的氨基酸序列同源性及氨基酸突變位點進行分析(圖8)。結果顯示獲得的8株PCV2 Cap蛋白氨基酸同源性為88.5%～100.0%，同屬于PCV2b分支的CH/HB/CZ01、CH/HB/CZ02和CH/HB/XJ01， 3株氨基酸序列之間同源性為100%，同屬于PCV2d分支的CH/HB/HS01、CH/HB/HD01、CH/HB/HD02和CH/HB/HD-03，4株氨基酸同源性為99.6%～100.0%，與GenBank中登錄的52株PCV2 Cap氨基酸參考序列之間同源性為88.5%～100.0%。對氨基酸突變位點進行分析可知，獲得的8株PCV2 Cap蛋白氨基酸序列之間存在多處突變，且存在一處變異程度較高的區(qū)域，即47～63 aa。CH/HB/HS01、CH/HB/HD01、CH/HB/HD02和CH/HB/HD03第53位的苯丙氨酸(F)突變?yōu)楫惲涟彼?I)，第169位(S)突變?yōu)?R)；CH/HB/CZ01、CH/HB/CZ02、CH/HB/XJ01第57位的(V)突變?yōu)楫惲涟彼?I)，第59位丙氨酸(A)突變?yōu)橘嚢彼?K)；CH/HB/XT01第57位蘇氨酸(T)突變?yōu)榻z氨酸(S)，第63位精氨酸(R)突變?yōu)樘K氨酸(T)，第185位亮氨酸(L)突變?yōu)榧琢虬彼?M)，第187位亮氨酸(L)突變?yōu)楫惲涟彼?I)，第190位蘇氨酸(T)突變?yōu)榻z氨酸(S)，第191位甘氨酸(G)突變?yōu)橘嚢彼?K)，第231位亮氨酸(L)突變?yōu)橘嚢彼?K)。

紅框代表主要抗原表位區(qū)域圖8 PCV2 Cap蛋白氨基酸序列分析

3 討論

近年來，由于豬圓環(huán)病毒疫苗的普遍使用，豬圓環(huán)病毒病在一定程度上得到了有效的控制，但大多數(shù)生豬養(yǎng)殖廠仍存在生長豬群感染PCV2的狀況，仍困擾著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。本試驗首先通過本實驗室建立的PCR病原檢測方法對收集的32份疑似PCV2感染的樣品進行初步篩選，共13份樣品呈PCV2陽性結果，其中1份樣品為僅PCV2感染，12份樣品為PCV2和PRV和(或)CSFV共感染，提示PCV2感染引起豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)及免疫功能下調(diào)，從而削弱PRV 和CSFV疫苗誘導的保護性細胞免疫應答[7-9]；PCV2陽性感染率為40.63%，與閆春春[10]運用熒光定量PCR方法對河北省部分地區(qū)規(guī)?；i場抽樣檢測發(fā)現(xiàn)PCV2感染率為 65%～89%的結果存在一定差異，該差異可能與地域因素有關。

CH/HB/XT01株病毒液的間接免疫熒光鑒定結果表明感染的PK-15細胞的胞漿內(nèi)有典型的特異性亮綠色熒光，一定程度上驗證了細胞發(fā)生大量脫落時處于PCV2感染PK-15細胞的中后期，導致病毒抗原轉移到了細胞漿中或病毒借助細胞內(nèi)的酶系統(tǒng)在細胞漿中合成了病毒抗原，產(chǎn)生PCV2特異性熒光[11-12]。透射電鏡結果顯示病毒粒子直徑約為20 nm，球形，邊緣清晰，呈無囊膜包裹的典型圓環(huán)病毒結構，該結果與蘇金存等[13]分離的安徽株PCV2病毒粒子結構一致。

為進一步了解獲得毒株的遺傳進化情況，本研究根據(jù)PCV2基因組和ORF2基因構建遺傳進化樹，發(fā)現(xiàn)獲得的8株PCV2基因組全長均為1 768 bp，分屬于PCV2a、PCV2b和PCV2d分支，其中CH/HB/XT01株屬于PCV2a分支，與中國山西毒株SXJX株同源性較高；CH/HB/CZ01、CH/HB/CZ02、CH/HB/XJ01同屬于PCV2b分支；CH/HB/HS01、CH/HB/HD01、CH/HB/HD02、CH/HB/HD03均屬于PCV2d分支。近年來針對河北省PCV2遺傳變異分析的研究不是很多，LI等[14]對2004-2014年間分離的12株PCV2陽性毒株進行分析，發(fā)現(xiàn)2009年以前PCV2分離株屬于PCV2b基因型，2009年以后轉向PCV2d基因型；劉玄福等[15]對2015-2017年河北北部的38份PCV2陽性組織進行分析，結果表明河北北部地區(qū)以PCV2b和PCV2d毒株流行為主；HAN等[16]對河北省2016-2019年PCV2進行回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)179份PCV2陽性組織中普遍存在PCV2a、2b、2d和2e 4種基因型。由此推斷，河北省近年來PCV2基因型呈多樣性發(fā)展，這可能是由于不同規(guī)模化養(yǎng)殖場外來引進種豬造成的。

目前，國內(nèi)使用的PCV2商品化疫苗主要有PCV2a和PCV2b 2個基因型，但由于PCV2抗原的多變性，使得疫苗對該病的防控效果存在一定局限性[15]。PCV2 ORF2基因較短，相對于PCV2全長基因組而言較容易進行基因組測序，因此常常作為遺傳進化分析的主要靶基因[17]。ORF2基因編碼的Cap蛋白是PCV2的主要抗原結構蛋白和免疫保護性抗原，被認為是PCV2中最易發(fā)生變異的結構蛋白，該氨基酸區(qū)域含有3個主要抗原表位(分別位于47～63 aa、165～200 aa和230～233 aa)[18]，在該區(qū)域中最容易發(fā)生基因變異，導致毒株致病力增強[19]，這也使其成為PCV2遺傳變異分析的主要結構區(qū)域之一。Cap蛋白的第59位丙氨酸、190位蘇氨酸和191位谷氨酸是構象中和表位的組成部分[20-21]，第77位天冬酰胺和206位異亮氨酸是抗體識別的關鍵殘基[22]。有研究表明，如果表位中的一個氨基酸發(fā)生突變，突變后的病毒不能被該表位的抗體識別[23]。因此，本試驗進一步對ORF2基因編碼的Cap蛋白氨基酸序列進行分析，結果表明獲得的8株PCV2的Cap蛋白氨基酸序列同源性為88.5%～100%，變異程度較大，多數(shù)存在6～7個單堿基的點突變，突變位置主要集中在53～90 aa區(qū)域，未發(fā)現(xiàn)基因插入或缺失突變。與國內(nèi)外其他參考序列相比變異程度不均一，所有變異均為點突變。本研究獲得的PCV2a毒株的氨基酸變異區(qū)主要集中在47～63 aa、165～200 aa和230～233 aa抗原表位區(qū)域，還有一些集中在71～90 aa非抗原表位區(qū)。該結果與薛瑞雪等[24]對山東部分地區(qū)流行的PCV2a的氨基酸序列分析結果一致；且本研究獲得的PCV2a毒株氨基酸變異區(qū)與PCV2a疫苗株氨基酸變異區(qū)相似，導致這一結果的原因可能是PCV2a型疫苗免疫效果不理想，無法對宿主產(chǎn)生100%的免疫保護。3株PCV2b毒株氨基酸變異區(qū)主要在47～63 aa區(qū)域，該結果與LYU 等[25]對中國南部地區(qū)PCV2分析略有差異，存在這種差異的原因可能與地域因素及種豬引進有關。PCV2d株的Cap蛋白序列中含有7個獨特的氨基酸(53 I、59 K、68 N、89 L、90 T、134 N、169 R)，這些氨基酸主要分布在病毒核衣殼表面，不能與SH株疫苗和LG株疫苗刺激機體產(chǎn)生的中和抗體反應。4株PCV2d毒株氨基酸突變主要集中在47～63 aa 和165～200 aa區(qū)域，其中包括第53位點的F突變?yōu)镮，第169位點S突變?yōu)镽，這些突變可能直接導致PCV2逃脫宿主免疫防御，從而促進PCV2在豬群中傳播。雖然目前PCV2疫苗被廣泛應用，但PCV2主要抗原表位區(qū)的點突變加速了病毒變異，從而使得PCV2逃逸宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，致使PCV2仍在豬群中流行。因此，為有效防控PCV2傳播，應加強對河北省不同區(qū)域內(nèi)PCV2遺傳進化的掌控。