龐 峰 (1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

羊口瘡 (orf) 又稱(chēng)為羊傳染性膿皰 (contagious ecthyma)，是由羊口瘡病毒 (orf virus,ORFV) 引起的一種急性、高度接觸性人畜共患病。該病主要感染綿羊、山羊等小反芻動(dòng)物，人也可被感染[1-2]。我國(guó)多個(gè)省份均報(bào)道過(guò)該病的發(fā)生和流行，該病的暴發(fā)和流行嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和人類(lèi)健康[3-5]。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類(lèi)具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)、沒(méi)有5′帽子和3′polyA 尾、耐RNA酶降解的內(nèi)源性非編碼RNA[6-8]。circRNA來(lái)源于mRNA前體的反向剪切，根據(jù)來(lái)源不同主要分為外顯子circRNA(exonic circRNAs，ecircRNAs)、內(nèi)含子circRNA(circular intronic RNAs ,ciRNAs)和外顯子-內(nèi)含子circRNA(Exon-Intron circRNA,EIciRNA)。circRNA廣泛存在于多個(gè)物種，具有穩(wěn)定性、保守性、組織和時(shí)空特異性[9-12]。越來(lái)越多的研究表明circRNAs在多種生物學(xué)過(guò)程如細(xì)胞增殖、分化、癌癥發(fā)生、先天免疫中扮演著重要的角色[12-16]。此外，circRNA在病毒與宿主互作機(jī)制中發(fā)揮重要作用[17-19]。然而，circRNA在ORFV感染中的作用尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)ORFV感染的GSF 細(xì)胞進(jìn)行circRNA測(cè)序，探索ORFV感染對(duì)GSF細(xì)胞circRNA表達(dá)譜的影響及差異circRNA在ORFV感染中的潛在功能，為ORFV致病機(jī)制研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料GSF細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，羊口瘡病毒ORFV-JS株由吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院邵洪澤研究員惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑胎牛血清、高糖DMEM、Ambion mirVana miRNA Isolation Kit、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 均購(gòu)自ThermoFisher Scientific 公司；Blood/Cell/Tissue Genome DNA Extraction Kit購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；pMD-19T載體購(gòu)自TaKaRa公司；2×SYBR qPCR Mix 購(gòu)自北京艾德萊生物公司；Green Taq Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其他試劑均為分析純。

1.3 RNA 提取待60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)GSF細(xì)胞達(dá)到90%聚合度，MOI=1接種ORFV-JS病毒(TCID50=106.2/mL)，37℃吸附1 h 后，吸掉病毒液，加入細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。對(duì)照組不加病毒，換為細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。感染組 (OV) 和對(duì)照組 (GSF) 各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。參照Ambion mirVana miRNA Isolation Kit 說(shuō)明書(shū)提取總RNA，-80℃保存。

1.4 去rRNA鏈特異性文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序樣品總RNA 質(zhì)檢合格后，使用epicentre Ribo-Zero試劑盒去除核糖體RNA (rRNA) ，純化回收的RNA被隨機(jī)打斷成短片段，以此為模板構(gòu)建6個(gè)cDNA文庫(kù)，文庫(kù)質(zhì)檢合格后采用Illumina Hiseq4000 測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為雙端2×150 bp (PE150) 。

1.5 circRNA的鑒定將線性方式無(wú)法比對(duì)到山羊參考基因組(GCF_001704415.1)的reads使用TopHat-Fusion按照非線性方式繼續(xù)比對(duì)。然后使用CIRCExplore 軟件對(duì)比對(duì)上的reads從頭組裝，根據(jù)circRNA結(jié)構(gòu)特征以及剪接序列特征鑒定circRNA。需滿(mǎn)足以下條件：剪切位點(diǎn)兩端必須是GU/AG；錯(cuò)配不大于2；Back-spliced junctions reads ≥ 1；2個(gè)剪切位點(diǎn)在基因組上距離 ≤ 100 kb。

1.6 circRNA 差異表達(dá)分析通過(guò)CIRCExplorer對(duì)circRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，基于公司開(kāi)發(fā)的腳本Scripts in house對(duì)不同樣本或處理之間的circRNA進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)。差異circRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2(fold change)|≥1，P≤0.05。

1.7 差異circRNA的GO和KEGG富集性分析Gene Oncology總共有3個(gè)本體，分別描述基因的分子功能(molecular function)、細(xì)胞成分(cellular component)、參與的生物過(guò)程(biological process)。GO的基本單位是GO term。首先把所有差異circRNA的親本基因向GO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)的各term映射，計(jì)算每個(gè)term的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在顯著性差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目，其計(jì)算公式為：

其中，N為基因總數(shù):n為N中差異表達(dá)基因的數(shù)目:M為注釋為某特定GO term的基因數(shù)目:m為注釋為某特定GO term的差異表達(dá)基因數(shù)目。P≤0.05定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO term。差異circRNA的KEGG富集性分析與GO 富集分析類(lèi)似，不再贅述。

1.8 差異circRNA的驗(yàn)證從差異表達(dá)circRNA中挑選相對(duì)高表達(dá) (FPKM>10) ，且3個(gè)生物學(xué)重復(fù)中至少在2個(gè)樣本中鑒定到的circRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。以總RNA為模板，使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后以cDNA為模板，使用divergent 引物擴(kuò)增circRNA。以2-△△Ct法計(jì)算表達(dá)差異。GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)做3次生物學(xué)重復(fù)。另外，分別以cDNA和基因組DNA(gDNA)為模板，使用divergent引物和convergent 引物進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物膠回收后連接到pMD-19T載體，送上海生工公司Sanger測(cè)序，鑒定circRNA的反向剪切位點(diǎn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析使用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P≤0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)下機(jī)后過(guò)濾掉接頭序列和低質(zhì)量原始序列，GSF組(GSF-1、GSF-2、GSF-3)和OV組(OV-1、OV-2、OV-3)分別平均得到83 697 556和91 192 170條有效reads (表1)；6個(gè)樣本的Q30均大于92%。GSF組和OV組平均有85.2%和86.7%的有效reads線性比對(duì)到山羊參考基因組(GCF_001704415.1)，對(duì)無(wú)法線性比對(duì)到參考基因組的有效reads進(jìn)行非線性比對(duì)，GSF組和OV組平均得到946 247條和843 165條back-spliced (反向剪切)reads。此外，將無(wú)法比對(duì)到山羊參考基因組的reads比對(duì)ORFV參考毒株NA1/11(KF234407.1)，OV-1、OV-2、OV-3樣本分別有125 619,165 878 和 157 779條reads 比對(duì)到ORFV NA1/11毒株基因組，而未感染的GSF組樣本比對(duì)ORFV基因組的reads數(shù)接近為0。將原始數(shù)據(jù)和處理后的數(shù)據(jù)上傳至NCBI的Gene Expression Omnibus 數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，登錄號(hào)為GSE121725。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 circRNA鑒定及特征利用CIRCExplorer軟件對(duì)6個(gè)樣本中circRNA 進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖1所示，GSF-1、 GSF-2、 GSF-3樣本中分別預(yù)測(cè)到4 639，4 603和4 834個(gè)circRNAs；OV-1、OV-2、OV-3樣本中分別預(yù)測(cè)到4 388，5 067和5 802個(gè)circRNAs。最終GSF組 ( 至少在1個(gè)樣本中預(yù)測(cè)到 ) 總共預(yù)測(cè)到9 979個(gè)circRNAs，OV 組總共預(yù)測(cè)到10 844個(gè)circRNAs，其中4 649個(gè)circRNA為兩者共有。6個(gè)樣本中預(yù)測(cè)到的circRNAs 約98%為外顯子circRNAs，剩余的為內(nèi)含子circRNAs(ciRNAs) 。這些circRNAs在染色體1到染色體29 均有分布，其中，染色體1，2，3，10和11 均產(chǎn)生超過(guò)800個(gè)circRNA。circRNA的長(zhǎng)度主要集中在100～2 000 bp之間。同一親本基因可產(chǎn)生1個(gè)至多個(gè)circRNA,其中有超過(guò)2 000個(gè)親本基因只能產(chǎn)生1個(gè)circRNA。

A.circRNA的數(shù)量統(tǒng)計(jì);B.circRNA的種類(lèi)統(tǒng)計(jì);C.circRNA的染色體分布;D.circRNA的長(zhǎng)度分布;E.來(lái)源同一親本基因的circRNA數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖1 circRNA的鑒定及特征

2.3 circRNA的差異表達(dá)分析設(shè)置差異circRNA的篩選閾值為:(|log2( fold change ) | ≥ 1,P≤ 0.05。結(jié)果如圖2所示，與未感染組 (GSF) 相比，ORFV感染組 (OV) 有59個(gè)circRNAs表達(dá)上調(diào)，92個(gè)circRNAs表達(dá)下調(diào)。

A.差異表達(dá)circRNA的柱狀圖;B.差異表達(dá)的circRNA的熱圖圖2 差異表達(dá)circRNA統(tǒng)計(jì)

2.3 差異circRNA的GO富集分析circRNA功能可能與其親本基因有關(guān)，因此，我們對(duì)差異circRNA的親本基因進(jìn)行了GO富集分析，分別取“生物學(xué)過(guò)程”(biological process)“分子功能”(molecular function)和“細(xì)胞成分”(cellular component) 3個(gè)本體的前20個(gè)顯著富集 (P<0.05 ) 的GO term作圖。結(jié)果如圖3所示，在細(xì)胞成分本體中，顯著富集的GO term主要是蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)(proteinaceous extracellular matrix)、質(zhì)膜(plasma membrane)，胞外區(qū)(extracellular region)等； 在分子功能本體中，顯著富集的GO term 主要是生長(zhǎng)因子結(jié)合(growth factor binding)、電壓門(mén)控鈉通道(voltage-gated sodium channel activity)、整合素結(jié)合(integrin binding)等；在生物學(xué)過(guò)程本體中，顯著富集的GO term 主要是炎癥應(yīng)答調(diào)控(regulation of inflammatory response)、上皮結(jié)構(gòu)維持(epithelial structure maintenance)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)控(positive regulation of cell migration)、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性的正向調(diào)控(positive regulation of ubiquitin-protein transferase activity)等。

圖3 差異circRNA的GO顯著富集分析

2.4 差異circRNA 的KEGG富集分析對(duì)差異circRNA親本基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析， 取前20個(gè)顯著富集(P< 0.05 )的信號(hào)通路作圖。結(jié)果如圖4所示，差異circRNA主要富集在緊密連接(tight junction)、黏著斑(focal adhesion)、血管平滑肌收縮(vascular smooth muscle contraction)、內(nèi)吞作用(endocytosis)、細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)等。

2.5 差異circRNA的驗(yàn)證首先篩選相對(duì)高表達(dá) (FPKM>10) ，且3個(gè)生物學(xué)重復(fù)中至少在2個(gè)樣本中鑒定到的差異circRNA，從中隨機(jī)挑選3個(gè)表達(dá)上調(diào)的circRNAs(circRNA5112,circRNA7880,circRNA8565)和6個(gè)表達(dá)下調(diào)的circRNA(circRNA998、circRNA1000、circRNA1001、 circRNA1684、circRNA3127、 circRNA4287)，設(shè)計(jì)divergent引物(表2)進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，以GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照，以2-△△Ct法計(jì)算表達(dá)差異。結(jié)果表明circRNA7880 表達(dá)上調(diào)，circRNA1001、 circRNA1684 和circRN3127 表達(dá)下調(diào)，與circRNA測(cè)序結(jié)果一致(圖5A)。

表2 差異circRNA的qPCR驗(yàn)證

為進(jìn)一步證明4個(gè)候選circRNA為真正的circRNA,分別以cDNA和GSF細(xì)胞gDNA為模板，使用divergent引物(擴(kuò)增circRNA)和convergent 引物(擴(kuò)增circRNA對(duì)應(yīng)的線性轉(zhuǎn)錄本)(表3)進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖5B)，PCR產(chǎn)物膠回收后連接到pMD-19T載體，送上海生工公司Sanger測(cè)序。結(jié)果表明，以cDNA為模板，使用divergent引物擴(kuò)增得到circRNA片段(*表示)，而以gDNA為模板無(wú)法擴(kuò)增得到circRNA；以cDNA或gDNA為模板，使用convergent引物均能擴(kuò)增出circRNA對(duì)應(yīng)的線性轉(zhuǎn)錄本。將擴(kuò)增得到的circRNA片段連接到pMD-19 T simple 載體，Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)4個(gè)circRNA中反向剪切位點(diǎn)存在(箭頭表示)(圖5C)。

A.qPCR驗(yàn)證差異circRNA的表達(dá)； B.以gDNA和cDNA為模板，使用會(huì)聚引物(??)和跨接頭引物(??)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。紅色星號(hào)表示circRNA;C.Sanger測(cè)序確定circRNA的反向剪切位點(diǎn)。箭頭指示反向剪切位點(diǎn)圖5 差異circRNA的qPCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證

表3 差異circRNA的驗(yàn)證引物

3 討論

近年來(lái)，orf在至全國(guó)呈廣泛流行，給養(yǎng)羊業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。之前對(duì)ORFV致病機(jī)制的研究主要集中在ORFV毒力基因或免疫調(diào)控基因的挖掘。目前已經(jīng)證明的ORFV毒力基因主要有ORFV132、ORFV127、ORFV125、ORFV119、ORFV117、ORFV112和ORFV020[20-26]。

ORFV的致病機(jī)理仍有很多未知，高通量測(cè)序成為研究ORFV與宿主的互作的強(qiáng)有力工具。最近，陳達(dá)香等[27-29]分別對(duì)ORFV感染的綿羊口腔粘膜、鼠源DC細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因顯著富集在免疫應(yīng)答、炎癥應(yīng)答、凋亡和細(xì)胞周期等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程；孔漢金等[30-31]則分別對(duì)ORFV感染的GSF細(xì)胞和DC細(xì)胞做了蛋白組測(cè)序，研究ORFV感染對(duì)宿主細(xì)胞蛋

白表達(dá)譜的影響。大量文獻(xiàn)表明宿主circRNA 在病毒感染過(guò)程中扮演著重要角色。然而，circRNA在ORFV感染中發(fā)揮何種作用尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此我們對(duì)ORFV感染的GSF 細(xì)胞進(jìn)行去核糖體circRNA測(cè)序，探究ORFV 感染對(duì)GSF 細(xì)胞circRNA表達(dá)譜的影響及circRNA在ORFV感染中的潛在功能。

在感染組和非感染樣本中分別鑒定到9 979 和10 844個(gè)circRNA， 這與circRNA在哺乳動(dòng)物中廣泛存在的報(bào)道相一致[6,11-12]。6個(gè)樣本中預(yù)測(cè)到的circRNAs 約98%來(lái)源于外顯子，而山羊卵泡細(xì)胞中的circRNA有 86% 屬于內(nèi)含子circRNA[32]， 這充分體現(xiàn)了circRNA 組織和細(xì)胞特異性的特點(diǎn)。與未感染GSF細(xì)胞相比，ORFV感染組總共得到151個(gè)差異表達(dá)circRNA，來(lái)源于90個(gè)親本基因。為了解circRNA的潛在功能，對(duì)差異circRNA進(jìn)行功能富集分析。GO富集分析表明，差異circRNA顯著富集在炎癥應(yīng)答調(diào)控、上皮結(jié)構(gòu)維持、細(xì)胞遷移的正向調(diào)控、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性的正向調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程。KEGG富集分析表明差異circRNA主要富集在緊密連接、黏著斑、血管平滑肌收縮、內(nèi)吞作用、細(xì)胞因子受體相互作用等信號(hào)通路。雖然本研究結(jié)果表明circRNA廣泛參與宿主對(duì)ORFV的應(yīng)答，但差異circRNA的具體功能，尤其是對(duì)ORFV復(fù)制的影響，將是今后需要進(jìn)一步研究的課題。