劉正尼 郭彥平 湯 睿

應(yīng)用補(bǔ)片材料修復(fù)腹壁缺損是腹壁疝的標(biāo)準(zhǔn)治療方式[1]。隨著生物補(bǔ)片豬小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS)在臨床應(yīng)用的增加，?？漆t(yī)師發(fā)現(xiàn)其植入后多數(shù)新生血管及膠原僅停留在補(bǔ)片表面，故組織重塑不充分造成修復(fù)部位力學(xué)支撐減弱，導(dǎo)致術(shù)后疝復(fù)發(fā)率較高[2]。有學(xué)者認(rèn)為，在補(bǔ)片制備中引入生長因子，并在補(bǔ)片植入后對其進(jìn)行活性釋放或可改善相關(guān)組織內(nèi)源性再生。補(bǔ)片植入后的初期為急性炎癥期，局部持續(xù)釋放的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可促進(jìn)早期新生血管生成，但對遠(yuǎn)期力學(xué)的促進(jìn)作用有限。組織進(jìn)入增殖階段后，TGF-β1可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為主的宿主細(xì)胞大量長入組織與補(bǔ)片的結(jié)合處，增殖、分泌膠原并沉積于交界處，加強(qiáng)該區(qū)域的力學(xué)強(qiáng)度[3]。進(jìn)入腹壁重塑階段后，SIS構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)逐漸被新生膠原替代，這是一個(gè)由邊緣修復(fù)逐漸向中央?yún)^(qū)域過渡的重塑過程，若中央?yún)^(qū)域缺乏有效融合，則ECM 的迅速降解可導(dǎo)致修復(fù)失?。欢诉^程能否順利完成與 TGF-β1水平密切相關(guān)[4]。研究[5]顯示，低水平TGF-β1可協(xié)同VEGF誘導(dǎo)，加速血管的生成與成熟化。此外，TGF-β1亦是異物植入后重要的免疫調(diào)節(jié)因子[6]。據(jù)此，本課題組將攜帶 TGF-β1納米球與 VEGF通過同軸靜電紡絲技術(shù)紡入絲素(silk fibroin, SF)纖維中形成可時(shí)序釋放2種因子的SF膜，模擬組織再生過程中的信號有序表達(dá)；通過將SF膜嵌入兩層SIS中，形成功能化生物補(bǔ)片，以減少SIS植入后的排異反應(yīng)；并實(shí)驗(yàn)性橋接、修補(bǔ)Sprague-Dawley(SD)大鼠的腹壁缺損，加速其成熟血管網(wǎng)絡(luò)形成和膠原結(jié)構(gòu)重塑；在補(bǔ)片植入28 d后，對模型大鼠進(jìn)行組織重塑評估；探索VEGF 和TGF-β1在血管成熟化及膠原沉積過程中的表達(dá)情況，闡明兩者在組織修復(fù)過程中的生物學(xué)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 SIS由本團(tuán)隊(duì)制備而成[7]。SF蛋白由浙江省桐鄉(xiāng)第二紡絲公司合成。人重組VEGF、TGF-β1、TNF-α和IL-6細(xì)胞因子及其ELISA試劑盒均購自美國R&D公司。小鼠單克隆抗體抗血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、膠原(collagen)Ⅰ和Ⅲ、纖連蛋白(fibronectin)、TGF-β1 抗體均購自美國Abcam公司。小鼠抗CD68+和CD15+抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 SF膜制備及生長因子釋放檢測 SF膜制備溫度為25～28 ℃，濕度≥60%。將10 μg VEGF溶解于2 mL SF水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%)中作為殼相溶液，含有TGF-β1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的SF納米球作為核相溶液，分別裝載于獨(dú)立針筒內(nèi)用于同軸靜電紡絲。紡絲針頭內(nèi)徑0.8 mm, 外徑 2.0 mm，核、殼相推注速度分別為0.4和1.2 mL/h，針尖距離接收裝置12 cm，電壓維持于18～20 kV。將制備好的SF膜置于真空條件、35 ℃的乙醇蒸汽中處理60 min后在空氣中干燥。應(yīng)用上述方法制備3種攜帶生長因子的SF膜：攜帶VEGF的SF膜(VSF膜)，攜帶TGF-β1的SF膜(TSF膜)，攜帶VEGF和TGF-β1的SF膜(VTSF膜)以檢測2種因子的釋放模式。將200 mg SF膜浸泡于10 mL PBS中勻速震蕩(37 ℃, 100 次/min)。每天提取1 mL上清液用于檢測，并補(bǔ)充1 mL PBS。通過ELISA試劑盒檢測相關(guān)SF膜7 d內(nèi)VEGF及14 d內(nèi)TGF-β1的釋放量，計(jì)算2種蛋白質(zhì)的裝載率和累計(jì)釋放率。將制備好的SF膜嵌于兩層SIS間，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的SF凝膠粘合各層形成SIS漿膜層朝外的3層結(jié)構(gòu)(即實(shí)驗(yàn)用補(bǔ)片)。并將其置于PBS中于 4 ℃下浸泡 2 h，過夜凍干后采用輻照射線消毒(25 kGy; 60Co)，儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 補(bǔ)片植入及術(shù)后處理 根據(jù)補(bǔ)片攜帶生長因子不同，分為VEGF(V組),TGF-β1(T組),VEGF和TGF-β1(VT組)及對照組(不含生長因子)。本研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員審查、批準(zhǔn)(SYXK2020-0002)。實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室動物使用和管理健康指南及術(shù)后管理標(biāo)準(zhǔn)(NIH N01-OD-4-2139, Rev.2)進(jìn)行操作。48只雄性、8周齡SD大鼠，每只250～300 g，購于上海斯萊克國家實(shí)驗(yàn)動物種子中心。大鼠術(shù)前禁食、禁水6 h，對應(yīng)相應(yīng)補(bǔ)片，隨機(jī)分為4組，每組12只。操作流程：以0.1 mg/g的1%戊巴比妥溶液予大鼠腹腔內(nèi)注射，術(shù)中根據(jù)麻醉效果適當(dāng)增加劑量至0.2 mg/g。取腹壁正中切口，切開皮膚及皮下組織，向兩側(cè)鈍性分離,顯露肌層。在腹直肌外側(cè)切除包含腹外斜肌、腹內(nèi)斜肌和腹橫肌的腹壁肌群，單側(cè)建立3 cm×1 cm的腹壁部分缺損模型，保留腹橫筋膜和腹膜完整性。將5 cm×4 cm的4種補(bǔ)片隨機(jī)植入實(shí)驗(yàn)大鼠兩側(cè)缺損處，短軸平行于腹白線，補(bǔ)片覆蓋缺損邊緣1 cm。以3-0普理林線間斷縫合、固定補(bǔ)片與缺損邊緣肌肉組織，5-0 薇喬線間斷縫合皮膚及皮下組織，無菌紗布覆蓋傷口。術(shù)后將大鼠分籠飼養(yǎng)，觀察其活動及進(jìn)食情況。

1.4 大體觀察和組織學(xué)分析 術(shù)后7、14、28 d分批對大鼠腹腔內(nèi)注射硫噴妥鈉溶液(40 mg/kg)，取材樣本為植入的補(bǔ)片及其周圍0.5 cm的正常組織，以進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)分析。①記錄大鼠手術(shù)區(qū)域的感染、血腫、血清腫、腹壁膨出和疝的復(fù)發(fā)情況。②術(shù)后第7天，收集各組大鼠腹腔內(nèi)滲液，離心后檢測TNF-α和IL-6水平。③分別采用抗CD15(1∶200)和抗CD68(1∶200)抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞水平。④行免疫熒光CD31(1∶100)染色評價(jià)植入補(bǔ)片區(qū)域的新生血管生成情況，即陽性染色血管數(shù)(個(gè))/組織觀察區(qū)域面積(mm2)；抗CD31(1∶100)和抗α-SMA(1∶100)雙抗體免疫熒光染色評價(jià)成熟血管生成情況，即CD31和α-SMA雙抗體染色陽性血管數(shù)/CD31染色陽性血管數(shù)；每個(gè)樣本均隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行計(jì)算；根據(jù)文獻(xiàn)[8]方法計(jì)算血管直徑和分類。⑤采用抗膠原Ⅰ(1∶100)、膠原 Ⅲ(1∶100)及抗纖連蛋白(1∶100)抗體行免疫熒光染色，評價(jià)補(bǔ)片植入后修復(fù)區(qū)域的ECM重塑情況；以膠原Ⅰ與膠原Ⅲ的比值評價(jià)膠原成熟度。⑥取材補(bǔ)片植入的中央?yún)^(qū)域行膠原Ⅰ免疫熒光染色，通過雙光子激光掃描顯微鏡進(jìn)行三維成像分析。數(shù)據(jù)分析由兩位研究員獨(dú)立應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行計(jì)算。

1.5 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)檢測 將植入28 d后的組織勻漿處理并提取蛋白質(zhì)。采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測組織中VEGF、TGF-β1、CD31、膠原Ⅰ(一抗稀釋比例分別為1∶500、1∶200、1∶500、1∶1 000)蛋白質(zhì)水平，以GAPDH(1∶1 000)作為對照計(jì)算上述指標(biāo)的灰度值，定量再生區(qū)域相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.6 力學(xué)性能檢測 對植入28 d后的組織取材，剪裁成30 mm × 10 mm條帶狀用于縱向力學(xué)測試。測試指標(biāo)包含應(yīng)力-應(yīng)變曲線、拉伸強(qiáng)度、楊氏模量及斷裂伸長。未植入的補(bǔ)片浸入PBS 2 h以維持材料濕態(tài)，作為對照組進(jìn)行上述力學(xué)測試。在濕態(tài)條件下將樣本置于model 5542電子織物強(qiáng)力儀(東華大學(xué))，兩端夾持長度為10 mm，拉伸速率為10 mm/min直至斷裂，計(jì)算和記錄拉伸過程中相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 VEGF和TGF-β1裝載率及累計(jì)釋放率 VSF膜和VTSF膜對VEGF的裝載率分別為(33.0±2.2)% 和(35.3±3.8)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.04,P>0.05)，7 d內(nèi)兩種膜的累計(jì)釋放率為(80.0±4.8)%。TSF膜和VTSF膜對TGF-β1的裝載率分別為(51.0±7.5)%和(45.3±5.8)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.20,P>0.05)，14 d內(nèi)兩種膜的TGF-β1累計(jì)釋放率分別為(39.5±2.6)% 和(32.5±2.3)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.03，P>0.05)。

2.2 補(bǔ)片植入后大體觀察及組織表面纖維化情況 各組補(bǔ)片被植入缺損位置進(jìn)行橋接修補(bǔ)。觀察期間無大鼠死亡及切口感染發(fā)生。術(shù)后14 d，對照組大鼠出現(xiàn)1例腹壁疝，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)在補(bǔ)片-組織結(jié)合處發(fā)生破裂。大體觀察顯示：術(shù)后7 d各組大鼠修復(fù)區(qū)域組織變薄，呈半透明狀(白色虛線標(biāo)記，圖1A～1D)；植入V組補(bǔ)片的大鼠在修復(fù)區(qū)域形成小膿腫(白色箭頭所示，圖1B),其余補(bǔ)片組未見膿腫形成。術(shù)后14 d，與V、T及VT組相比，對照組大鼠的腹壁組織修復(fù)程度最小(白色虛線標(biāo)記，圖1E-1H)。術(shù)后28 d，對照組大鼠中央?yún)^(qū)域部分纖維化(黃色箭頭所示，圖1I-1L)。

2.3 補(bǔ)片植入后宿主組織炎癥反應(yīng)情況 術(shù)后7 d，V組的CD15+水平顯著高于T組(t=2.82,P<0.05)和對照組(t=2.12,P<0.05)，但在術(shù)后14、28 d，3組CD15+水平均降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.00，P>0.05),見圖2A。術(shù)后7 d，含因子補(bǔ)片(V、T、VT組)的CD68+表達(dá)水平顯著高于對照組(F=17.60,P<0.05, 圖2B)；同時(shí)間點(diǎn)的TNF-α和IL-6的表達(dá)水平均顯著高于對照組(F=20.39,P<0.05,圖2C;F=87.52,P<0.05, 圖2D)。術(shù)后28 d，T組和VT組CD68+表達(dá)水平均顯著低于V組及對照組(F=27.60,P值均<0.05, 圖2B)，排異反應(yīng)顯著減輕。

2.4 補(bǔ)片植入后組織血管化情況 CD31免疫熒光染色結(jié)果顯示(圖3A)，術(shù)后28 d，VT組新生血管數(shù)量(5.5±0.4)顯著多于T組(3.6±0.5,t=4.21，P<0.05)、V組(3.0±0.5,t=4.23，P<0.05)及對照組(2.9±0.4,t=5.93，P<0.05)，后3組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.85，P>0.05)。CD31與α-SMA雙熒光染色合并結(jié)果顯示(圖3B)，VT組在術(shù)后28 d形成的成熟血管數(shù)量較V組[(41.6±5.8)比(27.6±5.2)，t=5.83，P<0.05]和T組顯著增加[(41.6±5.8)比(24.7±5.00),t=7.26，P<0.05]，主要由毛細(xì)血管、小靜脈和小動脈組成。各組毛細(xì)血管數(shù)量在成熟血管中占比的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.09，P>0.05)。VT組的小動、靜脈數(shù)量占成熟血管的比例為0.457，均顯著高于V組(0.385，t=5.09，P<0.05)和T組(0.326,t=5.09，P<0.05)。VT組的血管成熟度比例最高，為0.65。

A 補(bǔ)片植入術(shù)后7、14和28 d取材中央?yún)^(qū)域新生血管(即CD31陽性染色的血管)數(shù)量(n=4, ①P<0.05) B 補(bǔ)片植入術(shù)后28 d后取材中央?yún)^(qū)域成熟血管(即α-SMA/CD31雙熒光染色陽性)數(shù)量及其血管類型組成統(tǒng)計(jì)(n=4, ①P<0.05)

2.5 ECM重塑情況 術(shù)后28 d，與對照組及V、T組[(3.0±0.4)]%、(3.3±0.5)%和(4.6±0.6)%]相比，VT組的膠原Ⅰ熒光染色陽性的面積最大為(7.5±0.5)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.30，P<0.05，圖4A)。VT組的膠原Ⅰ/Ⅲ比值為2.1，均顯著高于V組、T組和對照組(1.3、1.6、1.0，F(xiàn)=18.57，P值均<0.05，圖4B),但仍低于人體腹直肌前鞘的生理數(shù)值(7.0)[8]。與對照組相比，V、T、VT組纖連蛋白染色陽性比例均顯著增加(P值均<0.05)；同時(shí)，VT組顯著高于V組(t=6.83，P<0.05)，與T組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.67，P>0.05,圖4C)。

A 補(bǔ)片植入術(shù)后7、14和28 d取材中央?yún)^(qū)域膠原Ⅰ陽性染色定量分析(n=4, ①P<0.05) B 補(bǔ)片植入術(shù)后28 d膠原Ⅰ/Ⅲ比值定量分析(n=4, ①P<0.05) C 纖連蛋白陽性染色定量分析(n=4, ①P< 0.05)。

在膠原Ⅰ染色的三維成像中，VT組呈現(xiàn)出大量膠原纖維集中、匯攏成束，相互緊密交織形成有序網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對照組則表現(xiàn)為松散、稀疏紊亂的結(jié)構(gòu)(圖5A)。VT組的膠原化體積[(46.9±6.3)×104mm3,t=4.10，P<0.05]和面積[(13.9±1.2)×104mm2,t=3.29，P<0.05]均顯著高于對照組[(14.3±4.5)×104mm3和(8.8±0.6)×104mm2](圖5B、5C)。表明VT組形成了更穩(wěn)固的ECM重塑，有利于抵抗動態(tài)腹內(nèi)壓的力學(xué)支撐。

A～C 補(bǔ)片植入術(shù)后28 d取材中央?yún)^(qū)域的膠原Ⅰ染色(綠)三維成像示意圖及比較分析(n=4, ①P<0.05)

2.6 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平 術(shù)后28 d，除TGF-β1外，V、T、VT組的蛋白質(zhì)水平均顯著高于對照組(P值均<0.05，圖6)。V組VEGF蛋白質(zhì)水平(0.30±0.03)顯著高于T組(0.13±0.01，t=10.48，P<0.05)，V組CD31蛋白質(zhì)水平(0.22±0.03)與T組(0.15±0.02)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.42，P>0.05)。T組TGF-β1(0.23±0.02)及膠原Ⅰ(0.42±0.05)蛋白質(zhì)水平均顯著高于V組[(0.09±0.01)、(0.24±0.03)，P值均<0.05]?；赩EGF和TGF-β1的協(xié)同作用，VT組的CD31和膠原Ⅰ的蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著高于V、T和對照組(P值均<0.05)。

1 V組 2 VT組 3 T組 4 對照組 A、B 補(bǔ)片植入后28 d不同補(bǔ)片取材組織中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)示意圖及定量分析，其中CD31和膠原Ⅰ以GAPDH為基準(zhǔn)計(jì)算灰度值(n=4, ①P<0.05)

2.7 力學(xué)性能比較 T組和VT組應(yīng)力-應(yīng)變曲線形態(tài)相似，而VT組的拉伸強(qiáng)度高于V組(t=8.53，P<0.05)和對照組(t=8.26，P<0.05，圖7A、7B)。較V組和對照組，T組和VT組分別具有更高的楊氏模量和更低的斷裂伸長率(P值均<0.05，圖7C、7D)。

A 應(yīng)力-應(yīng)變曲線(n=4) B 拉伸強(qiáng)度(n=4, ①P< 0.05) C 楊氏模量(n=4, ①P< 0.05) D 斷裂伸長率(n=4, ①P< 0.05)

3 討 論

與傳統(tǒng)組織間縫合的修補(bǔ)法相比，應(yīng)用補(bǔ)片修補(bǔ)腹壁疝術(shù)后患者疾病復(fù)發(fā)率顯著降低[8]。補(bǔ)片的作用是恢復(fù)腹壁形態(tài)、提供足夠的力學(xué)支撐以對抗腹內(nèi)壓。SIS是一種無免疫原性、富含膠原的脫細(xì)胞基質(zhì)。在植入宿主體內(nèi)后，需要通過誘導(dǎo)組織融合和重塑以替代原修補(bǔ)材料，從而提供力學(xué)支撐[9]。在前期研究[10]中，本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，未交聯(lián)的雙層SIS在植入術(shù)后2周因快速降解力學(xué)強(qiáng)度降至最低；因其重塑發(fā)展緩慢，術(shù)后4周力學(xué)強(qiáng)度才逐漸開始回升。在此過程中，一旦原先結(jié)構(gòu)崩塌，組織內(nèi)源性再生不足將導(dǎo)致修復(fù)失敗。

組織的修復(fù)及再生是一個(gè)需要多種細(xì)胞因子和生長因子等信號分子時(shí)序參與的復(fù)雜、有序過程。釋放外源性生長因子有利于細(xì)胞與基質(zhì)間的信息傳遞，加速引導(dǎo)新生膠原沉積和組織結(jié)構(gòu)重塑，從而加強(qiáng)修復(fù)區(qū)域的力學(xué)支撐。對于組織再生而言，時(shí)序釋放具有協(xié)同性的兩種生長因子可減少單一因子的用量，縮短修復(fù)和再生過程，避免因不規(guī)律地突釋因子所造成的不良修復(fù)結(jié)局[11]。生長因子的導(dǎo)入和控釋需要相關(guān)載體，采用靜電紡絲技術(shù)可以制備適用于活性蛋白的裝載和釋放的多層結(jié)構(gòu)。核層材料可通過包封的方式保護(hù)蛋白活性。殼層材料不僅可以延緩核層蛋白的釋放，同時(shí)也可以裝載活性蛋白，從而實(shí)現(xiàn)多種活性蛋白的時(shí)序釋放，為SIS的功能化改性提供技術(shù)支持[12]。

補(bǔ)片植入后的宿主融合是一個(gè)復(fù)雜但有序的過程。突釋VEGF可引起急性炎癥反應(yīng)激發(fā)明顯的中性粒細(xì)胞浸潤，其促炎作用是通過增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，并作為單核細(xì)胞趨化因子募集白細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)[13-14]。但在植入初期，所有含因子補(bǔ)片均可產(chǎn)生明顯的免疫排異反應(yīng)。一方面原因是，VEGF會加重SIS植入后的排異反應(yīng)；另一方面則為，TGF-β1納米球通過胞吞作用被巨噬細(xì)胞吞噬，因而募集和激活更多巨噬細(xì)胞，并隨多核異物巨細(xì)胞形成激發(fā)免疫排異反應(yīng)[15]。在本研究中，補(bǔ)片植入后初期TNF-α和IL-6的高水平狀態(tài)也是由上述因子通過促炎巨噬細(xì)胞的極化作用所致。但是，T組和VT組在術(shù)后28 d的排異反應(yīng)均已顯著減輕。表明TGF-β1作為抗炎細(xì)胞因子和巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮了有效抑制炎癥與減輕組織排異反應(yīng)的作用。

VEGF可間接促進(jìn)膠原分泌[16]。而對于TGF-β1在血管形成方面的作用仍存爭議。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)源性TGF-β信號可增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，而另一些學(xué)者的結(jié)論則恰恰相反[17-18]。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)或抑制血管形成的信號轉(zhuǎn)換取決于TGF-β水平，以及在內(nèi)皮細(xì)胞上的受體及激活的信號通路類型。在完成促血管反應(yīng)時(shí)，信號分子的類型和細(xì)胞間的交互作用比因子的攜帶量更為重要。在本研究中，VTSF膜的VEGF達(dá)到早期、快速釋放，TGF-β1形成持續(xù)、緩慢釋放。每張VTSF膜含VEGF 700 pg/mg, 可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管生成；而VTSF膜含TGF-β1與VEGF量之比被限制在1∶25，以利于形成低濃度持續(xù)表達(dá)TGF-β1的協(xié)同作用。兩者的時(shí)序釋放相比單一釋放更有利于CD31和膠原Ⅰ的表達(dá)，加強(qiáng)了VEGF的促血管作用，并通過調(diào)節(jié)ECM重塑形成更為穩(wěn)定和強(qiáng)韌的結(jié)構(gòu)。但VT組的力學(xué)強(qiáng)度仍低于人體腹直肌前鞘的生理數(shù)值(7.0)[20]。相反，單一突釋VEGF在管生長和成熟方面作用顯著。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，時(shí)序釋放VEGF和TGF-β1兩種因子的功能化補(bǔ)片比單獨(dú)釋放VEGF或TGF-β1補(bǔ)片具有更多的成熟血管生成及更好的組織結(jié)構(gòu)重塑，相比單獨(dú)釋放VEGF補(bǔ)片可提供更強(qiáng)的力學(xué)支撐。在初期釋放VEGF后持續(xù)釋放TGF-β1，將有助于血管生成和血管成熟；而初期釋放VEGF亦有助于TGF-β1促進(jìn)膠原沉積和成熟。因此，利用活性因子的協(xié)同效應(yīng)或可改善生物補(bǔ)片的修復(fù)效果，更有助于后續(xù)相關(guān)補(bǔ)片內(nèi)在生物化學(xué)機(jī)制的探索。