溫才寧，歐陽(yáng)侃，周曉瑩，秦轉(zhuǎn)，王大平*，段莉*

1.廣州醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣州 511436；2.深圳市第二人民醫(yī)院組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518035

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹鞯穆赃\(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重影響患者的運(yùn)動(dòng)功能[1]。OA是一個(gè)逐步退化的過(guò)程。在OA早期，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)被破壞，此時(shí)軟骨細(xì)胞的活性加強(qiáng)，意味著機(jī)體嘗試修復(fù)受損基質(zhì)。隨著炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及分解代謝的作用，膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)被侵蝕破壞，蛋白聚糖被分解消耗，軟骨細(xì)胞大量死亡，OA 進(jìn)入不可逆的受損狀態(tài)[2]。關(guān)節(jié)軟骨病損的修復(fù)已成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難題[3,4]。為此已開(kāi)展大量的體外和體內(nèi)研究工作。基于細(xì)胞水平開(kāi)展的體外實(shí)驗(yàn)設(shè)定的條件標(biāo)準(zhǔn)化和均一化，難以模擬反映在復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中藥物的代謝及療效[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究存在周期長(zhǎng)、需專用動(dòng)物飼養(yǎng)空間和人員和研究投入成本高等局限性。此外，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物在軟骨組織內(nèi)的分布代謝。因此，亟需建立一種研究模型，該模型既簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，又可高度模擬骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨病損修復(fù)過(guò)程，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物在軟骨組織內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。KGN 是一種小分子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KGN 在體內(nèi)和體外均可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化，能夠達(dá)到令人滿意的治療OA 效果[6]。KGN 已然成為治療OA 的代表性藥物。本研究團(tuán)隊(duì)在研究KGN 治療OA 上取得一定了成果。軟骨組織由豐富的膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，使得藥物較難滲入受損部位。本團(tuán)隊(duì)研究聚焦于OA 早期階段，希望藥物能在早期發(fā)揮作用控制OA 進(jìn)展。因此選擇健康豬的股骨軟骨，模擬在較完整的軟骨屏障上藥物的滲透情況。

1 材料和方法

1.1 試劑及材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豬為健康雄性五指山小型豬，25 kg，來(lái)源于有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證的單位，在符合實(shí)驗(yàn)要求的環(huán)境飼養(yǎng)；DMEM 培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素雙抗（GIBCO，美國(guó)）；KGN（Selleck，美國(guó)）；Rhodamine B -KGN（實(shí)驗(yàn)室合成）；甲苯胺藍(lán)溶液（北京索萊寶科技有限公司）；4.0 mm 活檢組織穿孔器（Miltex，日本）；CO2培養(yǎng)箱、冰凍切片機(jī)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬關(guān)節(jié)軟骨外植體的獲取與體外培養(yǎng) 無(wú)菌條件下，用40 mm 活檢組織穿孔器鉆取新鮮的豬關(guān)節(jié)軟骨組織，將獲取到的4.0 mm 豬關(guān)節(jié)軟骨外植體接種到48孔板中，每孔放置1個(gè)外植體，添加0.5 mL DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 Rhodamine B-KGN 合成 商品KGN 經(jīng)化學(xué)修飾先合成中間化合物：tert-butyl (2-(2-(2-(2-([1,1'-biphenyl]-4-ylcarbamoyl) benzamido) ethoxy) ethoxy)ethyl) carbamate；中間化合物再經(jīng)過(guò)修飾成Rhodamine B-KGN：N1-([1,1'-biphenyl]-4-yl)-N2-(2-(2-(2-(3',6'-bis(diethylamino)-3-oxospiro[isoindoline-1,9'-xanthen]-2-yl)ethoxy)ethoxy)ethyl)phthalamide。具體的合成及驗(yàn)證步驟本團(tuán)隊(duì)已發(fā)表在《Biomaterials》上[6]。

1.2.3 豬關(guān)節(jié)軟骨外植體的藥物滲透標(biāo)記 實(shí)驗(yàn)分成3 組：藥物滲透12 h 組、24 h 組、48 h 組，每組3 個(gè)樣本，于體外培養(yǎng)24 h 后加入Rhodamine B -KGN（1 μmol/L），37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間，冰凍切片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察KGN 在軟骨組織內(nèi)的滲透分布情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較使用one-way ANOVA進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 軟骨外植體獲取

用活檢組織穿孔器獲取豬關(guān)節(jié)軟骨外植體，呈圓柱狀，表面光滑無(wú)破損，直徑為4.0 mm（圖1）。

圖1 外植體直徑測(cè)量Fig.1 Explant diameter measurement

2.2 Rhodamine B-KGN在軟骨細(xì)胞中的滲透結(jié)果

激光共聚焦顯微鏡下觀察冰凍切片，結(jié)果顯示，藥物滲透12、24、48 h 組的豬關(guān)節(jié)軟骨外植體，組織為均勻的軟骨組織、軟骨陷窩中可見(jiàn)清晰完整的軟骨細(xì)胞（圖2）。熒光結(jié)果顯示，Rhodamine B -KGN 呈紅色熒光，Image J 結(jié)果如表1 所示，統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)圖3，48 h 組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（P＜0.01），隨著時(shí)間推移，滲透進(jìn)入軟骨細(xì)胞的Rhodamine B -KGN 明顯遞增。以上結(jié)果提示，豬關(guān)節(jié)軟骨外植體無(wú)血清培養(yǎng)模型在體外48 h 內(nèi)可維持正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，且小分子藥物在組織滲透遞送到軟骨細(xì)胞中。

圖3 熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析Fig.3 Statistical analysis of fluorescence intensity

表1 Rhodamine B-KGN熒光強(qiáng)度分析Tab.1 Fluorescence intensity analysis of Rhodamine B-KGN

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察外植體冰凍切片小分子藥物滲透情況(標(biāo)尺=50 μm)Fig.2 The permeation of small molecule drugs in frozen sections of explants was observed by confocal laser microscope（bar=50 μm）

3 討論

目前，小分子化合物已成為骨關(guān)節(jié)炎藥物研發(fā)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。其中，KGN 是由Johnson 等[7]從22 000多種結(jié)構(gòu)不同的雜環(huán)類藥性分子中篩選出的一種小分子化合物，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明KGN 能有效地促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示KGN 可有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨病損，從而發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的效應(yīng)[6～8]。

為突破體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)的局限性[9]，本研究通過(guò)體外無(wú)血清培養(yǎng)軟骨外植體，利用Rhodamine B標(biāo)記KGN，再進(jìn)行小分子藥物遞送滲透能力的檢測(cè)，動(dòng)態(tài)示蹤小分子藥物遞送進(jìn)入軟骨組織的全過(guò)程。組織學(xué)觀察顯示，體外培養(yǎng)的軟骨外植體可維持軟骨組織及軟骨陷窩內(nèi)的軟骨細(xì)胞的正常形態(tài)，且KGN可進(jìn)入軟骨組織內(nèi)部。由于關(guān)節(jié)軟骨是一種無(wú)血管、神經(jīng)和淋巴的組織，其基膜由高密度的膠原纖維網(wǎng)、蛋白聚糖和其他細(xì)胞外大分子構(gòu)成[10]；在體外培養(yǎng)條件下，小分子藥物可避免受到體內(nèi)關(guān)節(jié)的滑膜清除和血液及淋巴循環(huán)系統(tǒng)的影響[5]。因此，本項(xiàng)研究結(jié)果提示在體外培養(yǎng)的軟骨外植體模型中，無(wú)組織靶向性的小分子藥物可滲透進(jìn)入致密的軟骨組織，進(jìn)而發(fā)揮修復(fù)軟骨病損的效應(yīng)。

更重要的是，本研究建立的豬軟骨外植體體系，豬軟骨厚度為0.5～2.0 mm，與骨關(guān)節(jié)炎期間退化的人軟骨厚度極為接近[11]，是開(kāi)展關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)研究工作的理想模型。此外，該離體軟骨可取材于其它實(shí)驗(yàn)完成后的動(dòng)物，符合節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，最大程度減少動(dòng)物數(shù)目、關(guān)心動(dòng)物福利的實(shí)驗(yàn)原則。因此，本研究為開(kāi)展藥物遞送對(duì)關(guān)節(jié)軟骨病損的作用及其在骨關(guān)節(jié)炎治療中的應(yīng)用提供一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的研究策略，可在基礎(chǔ)研究、藥物研發(fā)和高通量篩選等領(lǐng)域推廣應(yīng)用。