凡丞，楊金蘭，王升

信陽市中心醫(yī)院，信陽 河南 464000

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）由Marshall 和Warren 在20 世紀(jì)80 年代首次從人胃黏膜中分離出來。近年來Hp 導(dǎo)致的我國人群感染率處在較高水平。慢性胃炎、胃潰瘍與Hp 感染關(guān)系密切。且Hp 引起的長期感染還可導(dǎo)致胃惡性腫瘤，其中包括胃癌和MALT 淋巴瘤［1］。Sugano 等［2］撰寫的報告中提出應(yīng)將Hp 感染相關(guān)性胃炎作為一種獨立的疾病看待。對于Hp 的傳統(tǒng)根除治療方案為抗菌藥物聯(lián)合質(zhì)子泵抑制劑，劣勢是副作用和日益凸顯的耐藥性。世界多地報道了Hp 對克拉霉素耐藥率大于15%［3-4］。質(zhì)子泵抑制劑的長期使用會引起消化系統(tǒng)、微量元素流失和心肌梗死風(fēng)險增加等不良反應(yīng)［5-6］。另外，還會引起腎臟和血液系統(tǒng)不良反應(yīng)［7-8］。因此，尋求副作用小、敏感度較高的治療方法十分必要。

近年來，國家大力扶持中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，以整體觀和辨證論治為根本的治療理念具有獨特優(yōu)勢，有望成為治療HP 相關(guān)性胃炎的新方案［9］。湖南中醫(yī)藥大學(xué)以蒲公英、黃芩、陳皮、青皮、白及、三七及烏賊骨為組分研制的滅幽湯在治療Hp 相關(guān)性胃炎的多項臨床研究［10-11］及動物試驗［12-13］中取得良好收效。但滅幽湯組分復(fù)雜，目前尚無針對滅幽湯治療HP 相關(guān)性胃炎的系統(tǒng)性研究，具體機制有待闡明。為此，本研究將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法探究滅幽湯治療HP 相關(guān)性胃炎的作用機制，以期為后續(xù)試驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 滅幽湯化學(xué)成分收集和活性成分的篩選

滅幽湯組方為蒲公英（20 g）、三七（6 g）、黃芩（15 g）、青皮（10 g）、陳皮（10 g）、白及（10 g）和烏賊骨（15 g），制備方法見文獻［12］。運用數(shù)據(jù)庫TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）及數(shù)據(jù)庫TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid）結(jié)合文獻搜集滅幽湯中各組分的化學(xué)成分，并賦予TCMSP 編號。以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)對搜集的化學(xué)成分進行活性成分篩選。

1.2 活性成分靶點篩選

運用TCMSP 數(shù)據(jù)庫對活性成分進行靶點預(yù)測，并得到對應(yīng)的靶蛋白全稱。以“Helicobacter pylori associated gastritics”為關(guān)鍵詞檢索Genecards 數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/）得到疾病相關(guān)基因。以“Homo Sapiens”為篩選標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）將藥物靶點和疾病靶點對應(yīng)的靶蛋白全稱進行標(biāo)準(zhǔn)化命名。通過取交集，獲得活性成分與疾病共有靶點。運用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建滅幽湯活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)模型，運用Network analyzer 工具分析活性成分degree 值，degree 值越高表明活性成分治療地位越重要。

1.3 靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點篩選

將滅幽湯活性成分與疾病共有靶點基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫（http://www.string-db.org/），物種選擇人類，得到蛋白互作關(guān)系數(shù)據(jù)的TSV 格式文件。將文件導(dǎo)入Cytoscape 得到蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，使用CytoNCA 插件篩選核心基因，并構(gòu)建子網(wǎng)絡(luò)。進一步使用CytoHubba 插件中提供的最大團中心性（maximal clique centrality，MCC）算法篩選TOP10核心基因。

1.4 分子對接

分別在PubChem 網(wǎng)站（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載活性成分和靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)SDF 格式文件。使用Pymol 對原始蛋白進行去水去配體。Openbable 軟件將活性成分保存為“mol2”格式。然后Autodock tools 軟件對活性成分和蛋白進行加氫、電荷分配操作，保存為“PDBQT”格式文件。運用Autodock Vina 軟件對“活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)”中degree 值前5 位的活性成分和degree 值前15 位且屬于PPI 互作網(wǎng)絡(luò)中TOP10 蛋白的靶點進行分子對接，使用結(jié)合能評估活性成分與蛋白的結(jié)合活性，結(jié)合能越小，對接活性越強，復(fù)合物越穩(wěn)定。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

將活性成分和疾病共有靶點輸入Metascape 網(wǎng)站（http://www.metascape.org/），物種選擇“H.Sapiens”，導(dǎo)出分析結(jié)果。收集GO 和KEGG 條目，以及與之對應(yīng)的基因數(shù)量（count）、-Log（p）值，運用Excel 2010 繪制條形圖。

2 結(jié)果

2.1 滅幽湯的活性成分

共得78 種活性成分，其中蒲公英15 種，黃芩36 種，陳皮5 種，青皮5 種，三七8 種，白及9種，烏賊骨主要由鹽和氨基酸構(gòu)成，本次未搜集到烏賊骨相關(guān)活性成分。共得到滅幽湯活性成分靶標(biāo)1 226 種，去重及除去未匹配到的基因后得到205 種。Gene cards 數(shù)據(jù)庫中共得到疾病相關(guān)靶標(biāo)871 種，與滅幽湯活性成分靶標(biāo)取交集后得到共有靶標(biāo)97 種，見圖1。剔除無關(guān)聯(lián)的活性成分，共得到作用于疾病的潛在活性成分62 種，其中蒲公英10 種，黃芩29 種，陳皮5 種，青皮5 種，三七7 種，白及6 種，見表1。62 種潛在活性成分與97 種“活性成分-疾病”共有靶標(biāo)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。

圖1 Hp相關(guān)性胃炎靶點與滅幽湯作用靶點的韋恩圖

圖2 滅幽湯“活性成分-潛在靶點”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

表1 滅幽湯治療Hp相關(guān)性胃炎的潛在活性成分

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

97 個活性成分與疾病共有靶點的初始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)包含97 個節(jié)點和2 026 條邊。經(jīng)CytoNCA插件對初始網(wǎng)絡(luò)中degree＞41 的節(jié)點構(gòu)建子網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)CytoHubba 插件對子網(wǎng)絡(luò)進一步篩選得到核心基因網(wǎng)絡(luò)圖，核心基因為前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（PTGS2）、腫瘤蛋白P53（TP53）、絲/蘇氨酸蛋白激酶B1（AKT1）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAKP3）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、原癌基因（JUN）、絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）和白介素6（IL6）。見圖3。

圖3 滅幽湯治療Hp相關(guān)性胃炎的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 GO 與KEGG 富集分析

通過GO 功能富集分析，滅幽湯治療Hp 相關(guān)性胃炎與1 781 個生物過程、60 個細(xì)胞組成以及111個分子功能存在相關(guān)性（P＜0.01）。根據(jù)P 值選取前10 個GO 條目繪制條形圖，見圖4，圖5。KEGG富集分析共得到241 條信號通路，選取前20 個信號通路繪制條形圖，主要包括癌癥途徑、IL-17 信號通路、NF-κB 信號通路和Hp 感染中的上皮細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，見圖6。

圖4 GO細(xì)胞元件富集分析

圖5 GO分子功能富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

2.4 活性成分與潛在靶點的分子對接

根據(jù)“1.4”中所示方法進行分子對接，結(jié)果顯示槲皮素、木樨草素、川陳皮素、柚皮素和β-谷甾醇分別與PTGS2、TP53、AKT1、CASP3 均具有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能均大于-5 kcal/mol。且與PTGS2 結(jié)合活性最高，見表2?；钚猿煞峙c靶點主要依靠氫鍵作用力結(jié)合，部分活性成分與靶蛋白的結(jié)合細(xì)節(jié)圖見圖7。

圖7 滅幽湯活性成分與核心靶點的分析對接圖

表2 滅幽湯關(guān)鍵活性成分與核心靶點的分子對接結(jié)果（kcal/mol）

3 討論

通過活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖可以看出滅幽湯中含活性成分最多的中藥依次為黃芩、蒲公英、三七、白及、陳皮和青皮。結(jié)合與靶標(biāo)的連接情況來看，度值排名前5 位的活性成分中，共有成分槲皮素、柚皮素、川陳皮素和β-谷甾醇以及來源于蒲公英的木樨草素與靶標(biāo)連接更密集。槲皮素為類黃酮化合物，結(jié)構(gòu)中含大量酚羥基，具有抗炎、抗細(xì)胞氧化［14］、抑制HP［15］等活性。木樨草素也屬于類黃酮化合物，其在體內(nèi)外抗炎活性均較強［16］，有研究表明木樨草素可通過改變Hp 感染胃癌CRL-1739 細(xì)胞ADAM-17、IL-8、IL-10 和NF-κB 的表達可能成為治療胃癌的潛在化合物［17］。川陳皮素可以誘導(dǎo)CD74 蛋白（幽門螺桿菌脲酶粘附蛋白分子）的表達，是一種抑制Hp 粘附和感染的候選化合物［18］。β-谷甾醇可通過介導(dǎo)AMPK、PTEN、和Hsp90 作用于胃腺癌細(xì)胞發(fā)揮抗癌作用［19］。本研究活性成分與疾病共有靶點97個，通過CytoNCA 和CytoHubba 插件提供的MCC 算法兩步篩選得到前10 位核心靶點，為PTGS2、TP53、AKT1、CASP3、MAKP3、VEGFA、JUN、MAPK8、MAPK1 和IL6。MCC 算法提供了較好的敏感度和特異度，更有利于精確發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點［20］。提示以上十個靶點在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵地位。

有文獻表明，部分靶點在Hp 相關(guān)性胃炎形成和進展階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中PTGS2 為環(huán)氧合酶，屬于誘導(dǎo)型酶，通常以較低活性存在于正常組織中，炎癥刺激可使其表達水平上調(diào)，經(jīng)過生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生前列腺素［21］，最終引起炎性反應(yīng)和疼痛。由此可見滅幽湯通過多種活性成分作用于PTGS2，這對治療Hp 相關(guān)性胃炎具有重要作用。JUN 編碼的是一種轉(zhuǎn)錄因子AP-1，Hp 可通過AP-1 刺激巨噬細(xì)胞，進而產(chǎn)生遞質(zhì)促進炎癥發(fā)生［22］。IL-6 是一種促炎細(xì)胞因子，有研究顯示其與胃炎炎癥程度呈正相關(guān)［23］。

GO 富集分析顯示，活性成分-疾病共有靶點主要參與對脂多糖的反應(yīng)、凋亡信號通路以及對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物過程?；贙EGG 通路富集分析可知，IL-17 信號通路、NF-κB 信號通路、Jak-STAT信號通路及Hp 感染中的上皮細(xì)胞信號傳導(dǎo)和癌癥途徑與胃炎密切相關(guān)。其中，NF-κB 信號通路可調(diào)節(jié)包括細(xì)胞因子和黏附分子等參與炎癥反應(yīng)的蛋白的基因轉(zhuǎn)錄過程，在胃炎到胃癌的發(fā)展進程中有重要調(diào)節(jié)作用［24-25］。IL-17 是一種促炎細(xì)胞因子。據(jù)報道，Hp 感染患者胃黏膜IL-17 蛋白的表達水平上調(diào)，而在根除Hp 后，IL-17 蛋白表達水平隨之下降［26］。本研究中，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)前10 位核心基因中PTGS2、IL-6 以及CASP3 皆分布在IL-17 信號通路圖中。JAK-STAT 信號通路是目前已知的三大炎癥信號通路之一，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等功能［27-28］。據(jù)報道，中草藥發(fā)揮抗Hp 作用主要集中在抗炎和抗癌相關(guān)的信號通路［29］，本研究結(jié)果顯示，前20 條信號通路中有諸多通路執(zhí)行的是炎癥和癌癥路徑。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法得到了滅幽湯的主要活性成分有槲皮素、柚皮素、川陳皮素、β-谷甾醇和木樨草素。主要通過作用于PTGS2、JUN 和IL6 等關(guān)鍵靶點來調(diào)控IL-17 信號通路、NF-κB 信號通路、Jak-STAT 信號通路來治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎。分子對接也初步證實degree值前五位的活性成分與PTGS2、TP53、AKT1 以及CASP3 有較好的結(jié)合活性，由此可見，滅幽湯中的活性成分可以通過作用于多個靶點來調(diào)控涉及炎癥、細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的信號通路來治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎。這對于進一步探究滅幽湯的作用機制以及發(fā)現(xiàn)治療相關(guān)的先導(dǎo)化合物具有前期借鑒價值。