蔣偉， 鄭東輝， 李海倫， 徐永

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院腎臟內(nèi)科，江蘇省淮安市 223002)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的并發(fā)癥之一，DN病程中晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGE)蓄積激活體內(nèi)活性氧，導(dǎo)致腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化、炎癥反應(yīng)和促纖維化因子產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)腎纖維化進(jìn)程從而影響腎臟的正常功能[1]，目前關(guān)于腎纖維化的分子機(jī)制仍不清楚。miR-125a-3p是近年新發(fā)現(xiàn)的纖維化相關(guān)微小RNA(microRNA，miRNA)，體外研究顯示miR-125a-3p可調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)累積[2]。也有研究顯示DN發(fā)生后miR-125a-3p降低，進(jìn)而參與DN視網(wǎng)膜病變[3]，提示miR-125a-3p可能參與DN腎纖維化，但其調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。P2RX7是一種ATP門(mén)控離子通道，參與調(diào)節(jié)免疫、炎癥和腫瘤的進(jìn)展，研究表明P2RX7藥理學(xué)抑制可緩解肝組織纖維化[4]，P2RX7對(duì)DN腎纖維化的機(jī)制仍不清楚。因此，本文探討miR-125a-3p靶向作用P2RX7對(duì)DN小鼠腎纖維化發(fā)展的影響。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

C57BL/6小鼠(SPF級(jí)，雄性，6周齡，20～25 g)。ELISA試劑盒、HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒(碧云天公司，中國(guó))。P2RX7質(zhì)粒、miR-125a-3p類(lèi)似物(mimic)及陰性對(duì)照(negative control，NC)(吉瑪公司，中國(guó))。TRIzol和mirNeasy mini試劑盒(QIAGEN GmbH公司，德國(guó))。SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa公司，日本)。PCR儀(ABI7900，ABI公司，美國(guó))。P2RX7一抗(ab48871)、膠原蛋白I(collagen I，Col-I)一抗(ab255809)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(ab40854)一抗(Abcam公司，美國(guó))。ECL顯色試劑盒和Nanodrop 2000儀器(Thermo Fisher公司，美國(guó))。腎胚細(xì)胞(ATCC公司，美國(guó))。突變?cè)噭┖泻蚏enilla熒光素酶(Beyotime公司，中國(guó))。熒光素酶試劑盒(Promega公司，美國(guó))。

1.2 小鼠建模和分組干預(yù)

60只C57BL/6小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、miR-125a-3p NC組和miR-125a-3p mimic組。除對(duì)照組外，其他小鼠參考文獻(xiàn)[5]高糖高脂配合STZ誘導(dǎo)構(gòu)建DN小鼠模型，小鼠尾靜脈空腹血糖>16.65 mmol/L、尿量>對(duì)照組50%提示建模成功。建模后miR-125a-3p NC組和miR-125a-3p mimic組DN小鼠分別腹腔注射miR-125a-3p NC或miR-125a-3p mimic(300 μg，每周2次)[6]；對(duì)照組和模型組注射等量生理鹽水為對(duì)照。8周后，收集小鼠尾靜脈血，安樂(lè)死小鼠收集腎組織。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-125a-3p表達(dá)

使用TRIzol試劑從腎組織中提取總RNA，Nanodrop 2000進(jìn)行定量。使用mirNeasy Mini試劑盒將miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Premix Ex TaqTM進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)：95 ℃ 2 min，58 ℃20 s， 72 ℃ 20 s(40個(gè)循環(huán))，以U6為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-125a-3p相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 Western blotting檢測(cè)P2RX7、Col-I、α-SMA蛋白

腎組織裂解后離心(4 ℃，12 000 r/min，5 min)收集總蛋白。10%SDS-PAGE分離40 μg蛋白，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。加入5%脫脂牛奶(室溫，2 h)封閉后加入抗-P2RX7、抗-Col-I、抗-α-SMA(1∶800，4 ℃，8 h)，洗滌后加入二抗(1∶2 000，室溫，1 h)。條帶用ECL可視化處理，GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算P2RX7、Col-I、α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 ELISA檢測(cè)血肌酐和血尿素氮

取小鼠尾靜脈血，半徑8 cm 3 000 r/min離心15 min，收集上清，分別加入抗體和顯色劑，終止顯色反應(yīng)后15 min內(nèi)檢測(cè)光密度(450 nm)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腎功能指標(biāo)血肌酐(creatinine，Cr)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。

1.6 HE染色觀察腎臟病理改變

腎組織用10%甲醛溶液固定48 h，流水沖洗。梯度乙醇脫水，然后將組織浸入蠟中，切5 μm厚度。載玻片65 ℃恒溫烘箱中30 min。脫蠟水化后染色。細(xì)胞核用蘇木精染色5 min，細(xì)胞質(zhì)用伊紅染色1～2 min。染色切片用乙醇脫水并在顯微鏡下觀察拍照。

1.7 Masson染色檢測(cè)腎纖維化

將1.6切片標(biāo)本加入Masson三色染料染色，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作，顯微鏡下觀察并拍照，利用IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算膠原蛋白體積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。

1.8 雙熒光素酶檢測(cè)miR-125a-3p與P2RX7靶向關(guān)系

通過(guò)Starbase網(wǎng)站得到miR-125a-3p與P2RX7的堿基結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)其原始序列，將P2RX7的3′端非翻譯區(qū)域(3′-untranslated region，3′-UTR)負(fù)載于pGL4熒光素酶載體上作為野生型(WT-)P2RX7；利用突變?cè)噭┖猩赏蛔冃?MUT-)P2RX7。根據(jù)上述轉(zhuǎn)染方法，分別將1 μg WT-/MUT-P2RX7及50 nmol/L miR-125a-3p mimic/ NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染1×104個(gè)人胚胎腎干細(xì)胞(HEK293)中。36 h后根據(jù)Renilla計(jì)算細(xì)胞熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組miR-125a-3p和P2RX7蛋白表達(dá)水平的比較

與對(duì)照組比較，其他3組P2RX7蛋白表達(dá)升高，miR-125a-3p表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組和miR-125a-3p NC組比較，miR-125a-3p mimic組上述趨勢(shì)得到逆轉(zhuǎn)(P<0.05；圖1和表1)。

圖1 各組P2RX7蛋白表達(dá)水平的比較1為對(duì)照組；2為模型組；3為miR-125a-3p NC組；4為miR-125a-3p mimic組。

表1 各組小鼠腎組織P2RX7蛋白和miR-125a-3p表達(dá)的比較(n=15)

2.2 miR-125a-3p對(duì)腎功能指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，其他3組Cr和BUN水平均升高(P<0.05)；與模型組和miR-125a-3p NC組比較，miR-125a-3p mimic組上述趨勢(shì)得到逆轉(zhuǎn)(P<0.05；表2)。

表2 miR-125a-3p對(duì)DN小鼠腎功能指標(biāo)的影響(n=15)

2.3 miR-125a-3p對(duì)腎組織病理學(xué)改變的影響

對(duì)照組細(xì)胞排列規(guī)則，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)完整；模型組和miR-125a-3p NC組腎小管出現(xiàn)明顯萎縮和紊亂，并出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)累積和炎性浸潤(rùn)；miR-125a-3p mimic組可觀察到基礎(chǔ)的腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)，組織損傷程度較模型組和miR-125a-3p NC組輕(圖2)。

圖2 miR-125a-3p對(duì)DN小鼠腎組織病理學(xué)改變的影響(HE染色，40×)

2.4 miR-125a-3p對(duì)CVF的影響

對(duì)照組著色均勻，無(wú)明顯藍(lán)色膠原纖維，提示腎組織正常，灰藍(lán)色或灰色為纖維化組織和膠原蛋白。模型組和miR-125a-3p NC組出現(xiàn)明顯藍(lán)色膠原纖維，提示腎組織異常；而miR-125a-3p mimic組出現(xiàn)少量藍(lán)色膠原纖維，較模型組和miR-125a-3p NC組少，提示腎組織部分異常。與對(duì)照組比較，模型組和miR-125a-3p NC組CVF均升高(P<0.05)；與模型組和miR-125a-3p NC組比較，miR-125a-3p mimic組上述趨勢(shì)得到逆轉(zhuǎn)(P<0.05；圖3)。

圖3 miR-125a-3p對(duì)DN小鼠腎組織纖維化的影響(Masson染色，40×)1為對(duì)照組；2為模型組；3為miR-125a-3p NC組；4為miR-125a-3p mimic組。a為P<0.05，與對(duì)照組比較；b為P<0.05，與模型組比較；c為P<0.05，與miR-125a-3p NC組比較。

2.5 miR-125a-3p對(duì)Col-I和α-SMA蛋白水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組和miR-125a-3p NC組Col-I和α-SMA蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組和miR-125a-3p NC組比較，miR-125a-3p mimic組上述趨勢(shì)得到逆轉(zhuǎn)(P<0.05；圖4)。

圖4 Western blotting檢測(cè)miR-125a-3p對(duì)DN小鼠Col-I和α-SMA蛋白水平的影響1為對(duì)照組；2為模型組；3為miR-125a-3p NC組；4為miR-125a-3p mimic組。a為P<0.05，與對(duì)照組比較；b為P<0.05，與模型組比較；c為P<0.05，與miR-125a-3p NC組比較。

2.6 miR-125a-3p對(duì)P2RX7的靶向作用

miR-125a-3p與P2RX7存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)染MUT-P2RX7和miR-125a-3p mimic后，細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性降低(P<0.05；圖5)，證明miR-125a-3p與P2RX7靶向結(jié)合。

圖5 miR-125a-3p對(duì)P2RX7的靶向調(diào)節(jié)作用A為miR-125a-3p與P2RX7結(jié)合位點(diǎn)；B為熒光素酶活性柱狀圖。a為P<0.05，與miR-125a-3p NC組比較；b為P<0.05，與MUT-P2RX7比較。

3 討 論

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN) 典型的病理改變?yōu)槟I小球及腎小管基底膜增厚、腎小管間質(zhì)纖維化等。若其纖維化得不到有效控制，則會(huì)發(fā)展為腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，甚至終末期腎功能衰竭[7]。

miRNA可通過(guò)堿基配對(duì)識(shí)別并結(jié)合mRNA，進(jìn)而誘導(dǎo)mRNA的降解或者抑制翻譯[8]。miR-125a-3p是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的與糖尿病和纖維化相關(guān)的miRNA，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DN會(huì)引起miR-125a-3p的水平升高，引起DN相關(guān)動(dòng)脈損傷[9]。miR-125a-3p 通過(guò)下調(diào)系統(tǒng)性紅斑狼瘡介導(dǎo)的腎炎小鼠中的TGF-β1表達(dá)來(lái)抑制腎纖維化[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-3p可以通過(guò)調(diào)控STAT3通路緩解成纖維細(xì)胞活化，此外，還可以調(diào)節(jié)自噬參與四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠模型肝纖維化[11-12]。為初步分析miR-125a-3p是否參與了DN引起的腎纖維化，本研究成功構(gòu)建DN模型，并成功促進(jìn)了腎纖維化，發(fā)現(xiàn)腎組織中miR-125a-3p水平降低。為進(jìn)一步證實(shí)miR-125a-3p在DN引起的腎纖維化中的作用，本研究利用miR-125a-3p mimic提高DN小鼠miR-125a-3p水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提高miR-125a-3p水平可顯著緩解DN小鼠腎組織損傷，抑制腎纖維化，保護(hù)腎功能。本研究在動(dòng)物水平上證實(shí)miR-125a-3p參與了DN誘導(dǎo)的腎纖維化，而提高miR-125a-3p水平可顯著緩解纖維化。

P2RX7蛋白是P2X7的受體，通過(guò)形成可滲透大分子的膜孔，負(fù)責(zé)巨噬細(xì)胞的ATP依賴(lài)性裂解[13]。研究顯示，P2RX7的接觸抗擊可減輕腎臟炎癥的早期階段、間質(zhì)纖維化，并與輸尿管梗阻中的腎細(xì)胞增殖有關(guān)[14]。也有研究顯示，抑制P2RX7通過(guò)抑制NLRP3/IL-1β通路而下調(diào)Col-I和α-SMA的表達(dá)，改善心臟纖維化[15]。Col-I是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，也是引起纖維化和腎功能障礙的重要蛋白[16]。α-SMA是促進(jìn)腎上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的重要蛋白，進(jìn)而促進(jìn)纖維化進(jìn)程[17]。本研究結(jié)果顯示，在DN纖維化腎組織中，P2RX7水平顯著升高，Col-I和α-SMA蛋白升高，而提高miR-125a-3p表達(dá)則會(huì)恢復(fù)P2RX7蛋白的表達(dá)水平，并抑制Col-I和α-SMA的表達(dá)。此外，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了miR-125a-3p與P2RX7靶向結(jié)合。本研究結(jié)果表明，DN會(huì)引起腎組織中miR-125a-3p的降低，從而導(dǎo)致P2RX7的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致Col-I和α-SMA蛋白的升高，引起腎纖維化；而提高miR-125a-3p的水平可通過(guò)抑制P2RX7蛋白等的水平抑制纖維化，保護(hù)腎功能。

然而，本研究也有一定的局限性，首先，miR-125a-3p與P2RX7的相關(guān)性以及在DN引起的腎纖維化的作用仍需要臨床研究證實(shí)，DN、miR-125a-3p以及P2RX7之間調(diào)控的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步分析。

綜上所述，miR-125a-3p升高會(huì)通過(guò)靶向抑制P2RX7蛋白的表達(dá)緩解DN引起的腎纖維化，保護(hù)腎功能。這提示miR-125a-3p/P2RX7可能是治療DN腎纖維化的新靶點(diǎn)。