宋晗， 田慶均

(1.武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院皮膚科，湖北省武漢市 430015；2.武漢市第一醫(yī)院皮膚科，湖北省武漢市 430022)

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)是發(fā)生于表皮或者附屬器細(xì)胞的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。CSCC治療以手術(shù)切除為主，但部分患者在切除后仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。單一藥物治療CSCC易產(chǎn)生耐藥性，效果不佳，而同時(shí)針對(duì)多個(gè)腫瘤靶點(diǎn)的聯(lián)合用藥治療有助于逆轉(zhuǎn)耐藥性。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)能穿透細(xì)胞膜干擾DNA修復(fù)和蛋白質(zhì)合成，從而抑制細(xì)胞增殖，單獨(dú)或聯(lián)合用于化療效果顯著，但會(huì)產(chǎn)生耐藥性[2-3]。蜂毒肽是蜂毒的主要活性物質(zhì)，具有抗菌、抗炎、抗病毒等效果[4]。研究表明，蜂毒肽可以激活細(xì)胞線粒體凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。本文探討蜂毒肽通過線粒體凋亡途徑促進(jìn)CSCC A431細(xì)胞株對(duì)5-FU敏感的機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞

人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞株與人正常皮膚HaCaT細(xì)胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司；40只健康SPF級(jí)雄性BALB/c裸鼠購于武漢貝賽模式生物科技有限公司，體質(zhì)量(20.00±2.00)g，使用許可證號(hào)SYXK(鄂)2022-0124，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(鄂)2022-0029。所有小鼠正常飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒、CCK8試劑盒、Annexin V/FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；RIPA裂解液購于上海翌圣生物科技有限公司；線粒體凋亡蛋白(Smac)、活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、細(xì)胞色素C(Cyt C)、促凋亡蛋白(Bax)兔抗人一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購于美國Abcam公司。

SpectraMax iD3 多功能酶標(biāo)儀購于上海美谷分子儀器有限公司；Cytek NL-CLC 全光譜流式細(xì)胞儀購于上海聚慕醫(yī)療器械有限公司；DYCZ-24DH型雙板垂直電泳儀、WD-9413D型一體式凝膠成像系統(tǒng)購于北京六一儀器廠。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與蜂毒肽濃度的篩選

取對(duì)數(shù)生長期的A431細(xì)胞，胰蛋白酶消化后收集并離心后用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸，在96孔板中加入100 μL細(xì)胞懸液(2×103個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后分別加入蜂毒肽，細(xì)胞培養(yǎng)液終濃度為0、0.125、0.25、0.5、1、2 μmol/L(設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，取出后加入10 μL 5 g/L CCK-8溶液。設(shè)置調(diào)零孔、空白孔。孵育1 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm的光密度值(optical density，OD)。細(xì)胞存活率(%)=(待測(cè)孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(空白孔OD值-調(diào)零孔OD值)×100%[6]，根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞毒性及細(xì)胞存活率

分別收集HaCaT、A431細(xì)胞，在96孔板中加入100 μL(2×103個(gè)/孔)細(xì)胞懸液，并分別分為對(duì)照組、蜂毒肽組、5-FU組、聯(lián)合組，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后對(duì)照組不作干預(yù)；蜂毒肽組用篩選的IC50濃度的蜂毒肽(0.5 μmol/L)作為終濃度培養(yǎng)；5-FU組用終濃度為0.25 μmol/L 5-FU溶液培養(yǎng)；聯(lián)合組用0.5 μmol/L蜂毒肽溶液和0.25 μmol/L 5-FU溶液共同培養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。取出加入10 μL 5 g/L CCK-8溶液。孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm OD值。細(xì)胞存活率計(jì)算公式同方法1.3。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞周期

各組A431細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，加100 μL 1×Binding Buffer重懸。加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution混勻。室溫下避光反應(yīng)15 min。加400 μL 1×Binding Buffer，混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

取上述離心后細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基重懸，以2×104個(gè)/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。棄去上清液，PBS洗2次，加70%乙醇固定細(xì)胞(4 ℃過夜)，向各孔中加300 μL 50 mg/L PI+10 μL 100 mg/L RNase，4 ℃中避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。

1.6 Western blotting法檢測(cè)Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表達(dá)水平

取1.5中各組細(xì)胞，收集后加200 μL RIPA裂解液，充分裂解后12 000 r/min離心，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)束后依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉(5%脫脂奶粉)、一抗孵育(1∶1 000稀釋)、二抗孵育(1∶500稀釋)，洗膜，用ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色。在凝膠成像儀中觀察目的蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算各蛋白的相對(duì)灰度值。

1.7 體外荷瘤檢測(cè)腫瘤生長抑制率

將40只BALB/c裸鼠隨機(jī)分為4組(對(duì)照組、蜂毒肽組、5-FU組、聯(lián)合組)，每組10只。取1.6中各組處于對(duì)數(shù)生長期的各組A431細(xì)胞在同一組名的裸鼠背部進(jìn)行皮下接種，每只裸鼠的接種量為0.3 mL(1×108個(gè)/mL)。在接種后的第3天開始測(cè)量腫瘤體積，此后每3天測(cè)量一次，接種后的第30天測(cè)量腫瘤體積后將各組裸鼠處死，飼養(yǎng)期間對(duì)照組有3只裸鼠死亡，蜂毒肽組有1只裸鼠死亡，剔除死亡裸鼠數(shù)據(jù)后，其他數(shù)據(jù)均納入統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)第30天腫瘤體積計(jì)算抑瘤率：腫瘤體積(V)=長×寬2/2；抑瘤率(%)=(1-V待測(cè)/V對(duì)照)×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0版軟件進(jìn)行分析處理，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蜂毒肽濃度篩選

隨著蜂毒肽濃度的增加，A431細(xì)胞存活率逐漸下降，IC50為0.51 μmol/L(圖1)。

圖1 不同濃度蜂毒肽對(duì)A431細(xì)胞存活率的影響

2.2 蜂毒肽對(duì)各組HaCa T細(xì)胞毒性的影響

與對(duì)照組和蜂毒肽組比較，72 h時(shí)5-FU組和聯(lián)合組的HaCaT細(xì)胞存活率降低(P<0.05;表1)。

表1 不同時(shí)間各組HaCaT細(xì)胞存活率的比較 單位：%

2.3 蜂毒肽對(duì)各組A431細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組比較，不同時(shí)間點(diǎn)蜂毒肽組、5-FU組、聯(lián)合組的A431細(xì)胞存活率均降低(P<0.05)；與蜂毒肽組和5-FU組比較，不同時(shí)間點(diǎn)下聯(lián)合組的A431細(xì)胞存活率均降低(P<0.05;表2)。

表2 不同時(shí)間各組A431細(xì)胞存活率的比較 單位：%

2.3 各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的比較

與對(duì)照組比較，蜂毒肽組、5-FU組、聯(lián)合組A431細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)；與蜂毒肽組和5-FU組，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05；圖2)。與對(duì)照組比較，蜂毒肽組、5-FU組、聯(lián)合組G0/G1期細(xì)胞比例增加(P<0.05)；與蜂毒肽組和5-FU組比較，聯(lián)合組G0/G1期細(xì)胞比例增加(P<0.05)。與對(duì)照組比較，蜂毒肽組、5-FU組、聯(lián)合組S期與G2/M期細(xì)胞比例降低(P<0.05)；與蜂毒肽組和5-FU組比較，聯(lián)合組S期與G2/M期細(xì)胞比例降低(P<0.05；圖3)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組A431細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)的凋亡情況a為P<0.05，與對(duì)照組比較；b為P<0.05，與5-FU組比較，c為P<0.05，與蜂毒肽組比較。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)的細(xì)胞周期a為P<0.05，與對(duì)照組比較；b為P<0.05，與5-FU組比較，c為P<0.05，與蜂毒肽組比較。

2.4 各組細(xì)胞Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表達(dá)水平的比較

與對(duì)照組比較，蜂毒肽組、聯(lián)合組的細(xì)胞的Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表達(dá)均增加(P<0.05)；與5-FU組和蜂毒肽組比較，聯(lián)合組細(xì)胞的Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表達(dá)均增加(P<0.05；圖4)。

圖4 各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)細(xì)胞中Smac，cleaved Caspase-3，Cyt C，Bax蛋白表達(dá)水平a為P<0.05，與對(duì)照組比較；b為P<0.05，與5-FU組比較，c為P<0.05，與蜂毒肽組比較。

2.5 各組腫瘤生長抑制率的比較

腫瘤生長第15～30天，與對(duì)照組、蜂毒肽組和5-FU組比較，聯(lián)合組的腫瘤體積縮小(P<0.05)。第30天蜂毒肽組、5-FU組、聯(lián)合組的腫瘤生長抑制率差異有顯著性(P<0.05；圖5)。

3 討 論

5-FU是一種抗嘧啶代謝藥物，其代謝產(chǎn)物可阻斷尿嘧啶脫氧核苷轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶脫氧核苷，阻止DNA和RNA的合成[7]。但長期使用5-FU會(huì)使腫瘤細(xì)胞的敏感性降低，產(chǎn)生耐藥性[8]。線粒體參與了細(xì)胞凋亡的過程，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷等外界刺激時(shí)，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑，促使細(xì)胞發(fā)生程序性凋亡[9]。

本研究中，蜂毒肽組、5-FU組、聯(lián)合組的A431細(xì)胞存活率降低，且聯(lián)合組降低更明顯，說明蜂毒肽可增強(qiáng)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。蜂毒肽是一種蜂毒中分離出的功能性物質(zhì)，約占蜂毒干重的50%，研究顯示，蜂毒肽可抑制人口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖存活率，抑制細(xì)胞遷移[10]。本研究中與蜂毒肽組和5-FU組比較，聯(lián)合組G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期與G2/M期細(xì)胞比例降低，且聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率更高，說明聯(lián)合使用蜂毒肽和5-FU可以將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，本研究中，聯(lián)合組腫瘤生長第30天的腫瘤生長抑制率較蜂毒肽組和5-FU組升高，說明蜂毒肽可協(xié)同增強(qiáng)5-FU抗腫瘤效果。研究顯示[11]，蜂毒肽可抑制非小細(xì)胞肝癌A549細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。由此，蜂毒肽與5-FU聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，聯(lián)合使用比單一使用效果更好。本研究中，蜂毒肽組、5-FU組、聯(lián)合組Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax表達(dá)增加，且聯(lián)合組增加更顯著。Bax是促細(xì)胞凋亡蛋白，正常情況下會(huì)在線粒體膜外抑制Cyt C與Smac的釋放。但在外界刺激的作用下Bax會(huì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，破壞線粒體膜的完整性，導(dǎo)致Cyt C與Smac從線粒體中釋放，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[12]。蜂毒肽可以通過激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞的凋亡，Smac與Cyt C蛋白的表達(dá)顯著上升[13]。

綜上，蜂毒肽可增強(qiáng)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，蜂毒肽和5-FU聯(lián)合使用可以將A431細(xì)胞有效阻滯在G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，這一作用可能是通過激活線粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。