周勇， 徐志淵， 王騫

(1.南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院腫瘤科，廣東省深圳市 518000；2.香港大學深圳醫(yī)院腫瘤科，廣東省深圳市 518058)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其形成涉及多種致癌基因的激活和抑癌基因的失活[1]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸且沒有編碼蛋白質潛能的非編碼RNA，其在癌癥中可表達異常，作為競爭性內源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)或分子海綿調控微小RNA(microRNA，miRNA)靶基因表達，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。生長停滯特異性5(growth arrest specificity 5，GAS5)在胃癌中扮演了分子海綿的角色調控miR-23a[3]。在膠質瘤中，GAS5過表達通過靶向多種miRNA分子抑制膠質瘤細胞惡性表型[4]。同時，GAS5被證實在宮頸癌中起抑癌作用，但其潛在分子機制尚不清楚[5]。因此，本研究重點探討宮頸癌HeLa細胞GAS5與miRNA的相互作用，以及GAS5表達對HeLa細胞增殖的影響，為宮頸癌的藥物開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

正常宮頸Ect1/E6E7細胞和宮頸癌HeLa細胞(中科院上海細胞庫)；Lipofectamine 3000轉染試劑盒、陰性對照(siR-NC)、GAS5 RNAi、pCDNA3.0-HA-GAS5質粒、miR-424 inhibitor和miR-424-mimic(上海吉凱生物公司)；雙熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；mRNA反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(北京金豪制藥股份有限公司)；四噻唑藍(methyl tihiazolyl tetrazolium，MTT)(日本同仁公司)；(Annexin)V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(武漢普諾賽生命科技有限公司)；DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，Dnmts)、組蛋白甲基化轉移酶(enhancer of zeste homolog2，EZH2)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3(serine/threonine protein kinase 3，Akt3)抗體(美國Santa Cruz公司)；HRP標記山羊抗鼠二抗(武漢博士德生物工程公司)；StepOne TM實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)；FACSVia流式細胞儀(美國BD公司)。PCR引物序列由吉林省奇健生物技術有限公司合成，GAS5上游5′-TCCTTAGGCATCACCTAGCC-3′，下游5′-GATGGAGGAAGTAGAGTCATTGG-3′；miR-424上游5′-G AGGCGATGCTATATTGTATCGT-3′，下游5′-GATCTTGCTTCTACTCCTACACGG-3′；U6上游5′-CATGCATCGGCATCACA-3，下游5′-AATGCTTCATGAATGTGCGT-3′。

1.2 組織來源

組織樣本來自本院2018年1月—2020年12月宮頸活檢后病理確診的原發(fā)性宮頸癌標本43例，年齡(49.16±5.43)歲，腫瘤直徑≤4 cm 19例、>4 cm 24例，轉移22例，F(xiàn)IGO分型Ⅰb～Ⅱa期17例、Ⅱb-Ⅲa期26例。選取同期因子宮肌瘤手術獲取的正常宮頸組織20例，年齡(48.23±4.15)歲。術后組織迅速保存于液氮中以備提取RNA，供后續(xù)試驗用。本研究獲得患者知情同意并簽署知情同意書，通過本院倫理審查委員會批準。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉染

37 ℃、5%CO2培養(yǎng)Ect1/E6E7細胞和HeLa細胞，融合至70%時進行下一步實驗。將HeLa細胞分為陰性對照組、miR-NC組、GAS5 RNAi組和GAS5質粒組。陰性對照組不處理，miR-NC組、GAS5 RNAi組和GAS5質粒組用Lipofectamine法分別將miR-NC、GAS5 RNAi和pCDNA3.0-HA-GAS5質粒轉染到HeLa細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行相關檢測。

1.4 熒光素酶報告基因檢測

通過生物信息學網站(www.Targetscan.org)預測篩選靶向GAS5的miRNA發(fā)現(xiàn)，GAS5與miR-424有潛在結合位點。將GAS5野生型(WT)/突變型(MUT)與miR-NC、miR-424 inhibitor和miR-424-mimic轉染到對數(shù)生長期HeLa細胞中，轉染48 h后，用雙熒光素酶檢測試劑分析熒光素酶活性。

1.5 實時熒光PCR檢測GAS5和miR-424 mRNA

取標本組織、對數(shù)生長期Ect1/E6E7細胞、HeLa細胞及3組轉染細胞接種于96孔板中，48 h后加入TRIzol提取總RNA，測定RNA，根據mRNA反轉錄試劑盒說明書操作將總RNA逆轉錄為cDNA，根據熒光定量PCR試劑盒說明操作，制備20 μL反應體系，在PCR擴增儀中進行擴增。反應條件為預變性95 ℃ 30 s、變性95 ℃ 5 s、60 ℃ 44 s、40個循環(huán)，采集熒光，2-ΔΔCt法計算GAS5和miR-424 mRNA相對表達量(以U6為內對照)。

1.6 MTT法檢測細胞增殖

處理后的細胞接種于96孔板中(5×103個/孔)，48 h后每孔加入MTT(20 μL個/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(200 μL個/孔)，振蕩10 min，用酶標儀測定光密度值(OD值)，計算細胞增殖率。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

處理后的細胞接種于6孔板中(3×105個/孔)，48 h后收獲細胞，用預冷磷酸鹽緩沖液洗滌，離心棄上清，分別加入5 μL膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC與PI，充分混勻后25 ℃避光孵育15 min，F(xiàn)ACSVia型流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 蛋白印跡法檢測Dnmts、EZH2和Akt3蛋白

處理后的細胞接種于6孔板中(3×105個/孔)，48 h后收獲細胞，加入100 μL細胞蛋白抽提液，冰上裂解30 min，進行電泳，轉膜，將膜與Dnmts(1∶500)、EZH2(1∶200)和Akt3(1∶400)4 ℃孵育過夜，洗膜后用HRP標記的二抗25 ℃孵育30 min，顯色后采集圖像并分析(以GAPDH為內對照)。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 lncRNA GAS5對miR-424的靶向調節(jié)作用

轉染miR-424-mimic可明顯降低GAS5-WT的熒光素酶活性，對GAS5-MUT沒有影響，而miR-424-inhibitor則表現(xiàn)出相反作用，表明GAS5與miR-424存在靶向調節(jié)作用(P<0.05；圖1)。

圖1 lncRNA GAS5對miR-424的靶向調節(jié)作用A為互補配對；B為熒光素酶活性。a為P<0.05，與陰性對照組比較；b為P<0.05，與miR-NC組比較；c為P<0.05，與miR-424 inhibitor組比較。

2.2 各組GAS5和miR-424 mRNA表達的比較

宮頸癌組織、HeLa細胞GAS5和miR-424 mRNA水平分別低于正常宮頸組織或Ect1/E6E7細胞(P<0.05；表1)。以GAS5或miR-424 mRNA均數(shù)為標準，將宮頸癌患者分為低表達組和高表達組。

表1 GAS5和miR-424 mRNA在組織和細胞中表達的比較

2.3 不同臨床病理特征宮頸癌患者GAS5、miR-424表達的比較

GAS5和miR-424低表達率有轉移的宮頸癌患者高于無轉移患者，F(xiàn)IGO分型Ⅱb～Ⅲa型患者高于Ⅰb～Ⅱa型患者(P<0.05；表2)。

表2 不同臨床病理特征宮頸癌患者GAS5、miR-424表達比較 單位：例(%)

2.4 轉染GAS5對GAS5和miR-424 mRNA表達的影響

與陰性對照組和miR-NC組比較，HeLa細胞GAS5和miR-424 mRNA相對表達量GAS5 RNAi組降低，GAS5質粒組增加；GAS5質粒組高于GAS5 RNAi組(P<0.05；表3)。

表3 轉染GAS5對HeLa細胞GAS5和miR-424 mRNA表達的影響

2.5 轉染GAS5對細胞增殖及凋亡的影響

與陰性對照組和miR-NC組比較，HeLa細胞增殖率GAS5 RNAi組升高，GAS5質粒組降低；HeLa細胞凋亡率GAS5 RNAi組降低，GAS5質粒組升高(P<0.05)。與GAS5 RNAi組比較，GAS5質粒組細胞增殖率降低，凋亡率升高(P<0.05；圖2)。

圖2 轉染GAS5對HeLa細胞增殖和凋亡的影響1為陰性對照組；2為miR-NC組；3為GAS5 RNAi組；4為GAS5質粒組。a為P<0.05，與陰性對照組比較；b為P<0.05，與miR-NC組比較；c為P<0.05，與GAS5 RNAi組比較。

2.6 轉染GAS5對Dnmts、EZH2和Akt3蛋白表達的影響

與陰性對照組和miR-NC組比較，HeLa細胞Dnmts、EZH2表達GAS5 RNAi組降低，GAS5質粒組增加；Akt3表達GAS5 RNAi組增加，GAS5質粒組降低(P<0.05)。與GAS5 RNAi組比較，GAS5質粒組Dnmts、EZH2表達增加，Akt3表達降低(P<0.05；圖3)。

圖3 轉染GAS5對HeLa細胞中Dnmts、EZH2和Akt3蛋白表達的影響1為陰性對照組；2為miR-NC組；3為GAS5 RNAi組；4為GAS5質粒組。a為P<0.05，與陰性對照組比較；b為P<0.05，與miR-NC組比較；c為P<0.05，與GAS5 RNAi組比較。

3 討 論

lncRNA是細胞生物學中重要的調控因子，其異常表達與腫瘤發(fā)生密切相關。研究表明，GAS5在腫瘤進展中起著重要作用。GAS5下調與結直腸癌和非小細胞肺癌的晚期腫瘤分期和低生存率相關[6]。GAS5在胰腺癌中的異常表達與胰腺癌侵襲及預后不良有關[7]。本研究結果顯示，GAS5在HeLa細胞和宮頸癌組織中表達下調。此外，通過基因干預，促進GAS5表達能抑制HeLa細胞增殖，誘導HeLa細胞凋亡。這些結果提示GAS5在宮頸癌中是一種抑癌基因。近年來的研究表明，lncRNA與miRNA之間存在一種新的調控機制。例如，lncRNA MALAT1通過海綿化miR-22作為競爭性內源性RNA促進惡性黑色素瘤的生長和轉移[8]；lncRNA CASC2通過海綿化miR-18a在結直腸癌中作為內源性競爭RNA發(fā)揮作用[9]。本研究通過生物信息學分析和隨后的雙熒光素酶報告基因檢測證明，GAS5作為ceRNA競爭性海綿miR-424。同時，RT-PCR顯示HeLa細胞和宮頸癌組織中miR-424表達降低。此外，促進GAS5表達能誘導miR-424表達。在癌癥相關miRNA中，miR-424可以作為腫瘤抑制因子，例如在乳腺癌、宮頸癌和骨肉瘤中低表達[10]。在膠質瘤組織中，miR-424水平明顯低于鄰近正常腦組織，miR-424過表達能促進神經膠質瘤細胞的凋亡，表明miR-424具有腫瘤抑制活性[11]。因此，GAS5可能至少部分通過誘導miR-424的表達來抑制宮頸癌細胞增殖。有趣的是，miR-424啟動子區(qū)域內的CpG島甲基化是其在腫瘤組織中下調的原因。然而，對負責miR-424啟動子甲基化或其腫瘤抑制活性的機制知之甚少。

DNA甲基化的全基因組模式在惡性腫瘤組織和正常組織之間發(fā)生顯著變化，與疾病進展和患者存活率相關。Dnmts通過與不同物質形成復合物，嚴格調節(jié)DNA序列特異性和非特異性CpG甲基化。同時，高甲基化基因在EZH2基因中也高度富集，支持EZH2介導DNA從頭甲基化[12]。從機制上講，EZH2和Dnmts之間的直接相互作用充當后者的募集平臺，并且是EZH2靶向啟動子的DNA甲基化所必需的[13]。同時，EZH2是維持miRNA和lncRNA表達所必需的，這是通過EZH2和Dnmts之間的直接相互作用以及后者與啟動子的隔離來實現(xiàn)的。進一步實驗表明，GAS5可以上調EZH2，并與Dnmts直接相互作用[14]。在膠質瘤細胞中，過表達EZH2逆轉了miR-424啟動子內的CpG甲基化，并提高miR-424的表達[15]。對肝癌的研究發(fā)現(xiàn)，Akt3是miR-424的直接靶點，可以減弱miR-424的生物學效應[16]。宮頸癌或肺癌的研究也支持miR-424和磷脂酰肌醇3激酶/Akt信號之間的負調控[17]。使用miR-424模擬物或抑制劑治療膠質瘤細胞時Akt3的變化與多種活性基因的變化相關，包括細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和B細胞淋巴瘤/白血病-2，這表明抑制Akt3可能至少有助于miR-424對細胞生長的影響[18-19]。本研究結果顯示，促進GAS5表達后，HeLa細胞中Dnmts和EZH2表達增加、Akt3表達降低，也證實了GAS5通過調控miR-424發(fā)揮抗腫瘤細胞增殖的作用。

綜上所述，lncRNA GAS5通過靶向調控miR-424的表達，抑制宮頸癌HeLa細胞增殖，可能成為宮頸癌患者治療的潛在靶點。