賈文歆， 于振江， 王麗香， 周雪梅

(濟(jì)南市第八人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東省濟(jì)南市 271104)

缺血性腦卒中又稱腦卒中，是心腦血管疾病中常見類型，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，是全世界第二大死因[1]，目前缺乏有效治療方法，對(duì)存活者生存質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是大腦認(rèn)知功能基礎(chǔ)，大腦缺血再灌注通常會(huì)伴有神經(jīng)功能受損，且其損傷不可逆[2]，故此保護(hù)神經(jīng)功能，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)進(jìn)而降低致殘率已成為目前缺血性腦卒中亟需解決的難題。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)不具有編碼蛋白功能[3]，但其在表達(dá)遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多方面發(fā)揮重要作用[4]。有研究證實(shí)，lncRNA C2dat2可以促進(jìn)腦出血后神經(jīng)元存活[5]。但lncRNAs在動(dòng)脈栓塞再灌注過程中的調(diào)控作用尚不明確。本研究就lncRNA C2dat2對(duì)小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注損傷(middle cerebral artery occlusion-reperfusion injury，MCAO/R)及神經(jīng)元自噬、凋亡的影響進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱購自合肥賽帆試驗(yàn)設(shè)備有限公司；RNA提取試劑TRIzol及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自武漢極捷生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液及BCA法蛋白測定試劑盒購自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光液、蘇木精-伊紅染色液購自北京伊塔生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒購自武漢益普生物科技有限公司；LONZA ELx808酶標(biāo)儀購自北京澤平科技有限責(zé)任公司；Bio-Rad伯樂PCR儀T100購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司；磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase，p-p38MAPK)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine protease protein，Caspase-3)、兔抗大鼠LC3多克隆抗體和兔抗大鼠LC3Ⅱ多克隆抗體、Beclin 1山羊多克隆抗體和GAPDH、β-actin購于Cell Signaling Technology公司。shRNA由上海漢恒生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并提供。

1.2 動(dòng)物及分組

清潔級(jí)SD小鼠60只，8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量(20.01±2.11)g，購于吉林四長制藥有限公司，許可證號(hào)SYXK(吉)2020-001。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，飼養(yǎng)條件是光照/黑暗時(shí)間各12 h，相對(duì)空氣濕度45%～55%，溫度22～26 ℃，可自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組、negative shRNA組和C2dat2 shRNA組，每組15只小鼠，后兩個(gè)shRNA組模型建立后在小鼠側(cè)腦室用0.5 ng/kg相應(yīng)shRNA注射。

1.3 MCAO/R模型建立

參考文獻(xiàn)[6]，采用10 g/L戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠，沿頸部正中備皮消毒后切開皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉組織，露出頸總、頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈；將尼龍魚線制成的線栓自頸內(nèi)動(dòng)脈穿入，經(jīng)頸總動(dòng)脈栓塞大腦中動(dòng)脈；血管阻塞60 min后拔出線栓，恢復(fù)灌注。假手術(shù)組不阻斷頸總動(dòng)脈，其余操作與其他組相同。

1.4 腦組織病理觀察

經(jīng)腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉麻醉小鼠，采用脫頸椎法處死小鼠，取出腦組織，固定于10%福爾馬林溶液中，采用常規(guī)方式進(jìn)行脫水、包埋、切片處理。經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色后，置于顯微鏡下觀察。

1.5 神經(jīng)功能缺陷評(píng)估

通過改良神經(jīng)功能缺陷評(píng)分[7]評(píng)價(jià)小鼠神經(jīng)功能改變情況，評(píng)分內(nèi)容包括提尾實(shí)驗(yàn)、行為功能、感覺實(shí)驗(yàn)、平衡木實(shí)驗(yàn)及反射實(shí)驗(yàn)，總分20分，分值越高行為缺陷越嚴(yán)重。

1.6 TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡

取出的腦組織脫水后浸蠟包埋，然后將蠟塊切成厚度5 μm的切片，脫蠟后進(jìn)行TUNEL染色。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察切片中腦組織細(xì)胞的凋亡水平。

1.7 實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測Caspase-3、p-p38 MAPK mRNA表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測Caspase-3、p-p38 MAPK mRNA表達(dá)。采用TRIzol法提取組織總RNA，采用紫外分光光度計(jì)法測定RNA水平。按TaqMan? MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，置于4 ℃保存，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃5 min預(yù)變性；95 ℃變性10 s，60 ℃退火35 s，65 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。以β-action為內(nèi)參，Caspase-3上游：5′-GAGCTTGGAA CGCGAAGAAA-3′，下游：5′-TCAATACCGCGCAGTCCAGCTC-3′；MAPK上游：5′-GAGCTGCGTCGAAC CGT-3′，下游5′-CCTCCCAGACGGTCTTGTTC-3′；β-action上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-ACGCTTCACG AATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCT法計(jì)算Caspase-3、p-p38 MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.8 Western blotting檢測自噬蛋白

取梗死周圍區(qū)域腦組織，放入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Belin 1自噬蛋白水平。沸水浴中10 min，電泳后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。次日PBS洗滌3次，然后加入相應(yīng)二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，發(fā)光液進(jìn)行顯色，以GAPDH為內(nèi)參。在ECL試劑盒進(jìn)行顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA C2dat2對(duì)大腦組織病理學(xué)改變的影響

假手術(shù)組小鼠大腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元細(xì)胞胞體大小正常，呈多角形，染色均勻，核仁明顯。模型組大腦皮層區(qū)出現(xiàn)明顯缺血灶，腦組織明顯水腫，神經(jīng)細(xì)胞排列無規(guī)則，并可見大量細(xì)胞變性壞死。negative shRNA組與模型組病理改變類似。C2dat2 shRNA組與假手術(shù)組組織形態(tài)接近，有少量神經(jīng)細(xì)胞壞死(圖1)。

圖1 lncRNA C2dat2對(duì)MCAO/R小鼠大腦組織病理學(xué)改變的影響(HE染色，200×)

2.2 lncRNA C2dat2對(duì)神經(jīng)功能的影響

與假手術(shù)組比較，小鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分其他組均明顯升高，且同組比較，評(píng)分隨時(shí)間依次下降，C2dat2 shRNA組評(píng)分低于同時(shí)間negative shRNA組(P<0.05；表1)。

表1 lncRNA C2dat2對(duì)MCAO/R小鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分的影響(n=15) 單位：分

2.3 lncRNA C2dat2對(duì)大腦細(xì)胞凋亡的影響

模型組和negative shRNA組細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組，C2dat2 shRNA組細(xì)胞凋亡率低于negative shRNA組(P<0.05；圖2)。

圖2 lncRNA C2dat2對(duì)MCAO/R小鼠大腦細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL染色，200×)1為假手術(shù)組；2為模型組；3為negative shRNA組；4為C2dat2 shRNA組。a為P<0.05，與假手術(shù)組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

2.4 lncRNA C2dat2對(duì)腦組織自噬蛋白水平的影響

模型組和negative shRNA組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Belin 1水平高于假手術(shù)組，C2dat2 shRNA組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Belin 1水平低于negative shRNA組(P<0.05；圖3)。

圖3 lncRNA C2dat2對(duì)MCAO/R小鼠腦組織自噬蛋白水平的影響1為假手術(shù)組；2為模型組；3為negative shRNA組；4為C2dat2 shRNA組。a為P<0.05，與假手術(shù)組比較；b為P<0.05，與negative shRNA組比較。

2.5 lncRNA C2dat2對(duì)Caspase-3和p-p38 MAPK mRNA水平的影響

模型組和negative shRNA組Caspase-3和p-p38MAPK表達(dá)水平高于假手術(shù)組，C2dat2 shRNA組Caspase-3和p-p38MAPK表達(dá)水平低于negative shRNA組(P<0.05；表2)。

表2 lncRNA C2dat2對(duì)MCAO/R小鼠腦組織Caspase-3和p-p38MAPK mRNA水平的影響(n=15)

3 討 論

本研究構(gòu)建小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注損傷模型，經(jīng)腦側(cè)注射negative shRNA或C2dat2 shRNA，觀察小鼠腦組織病理變化，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠大腦皮層區(qū)出現(xiàn)明顯的大腦動(dòng)脈栓塞再灌注的特征；而C2dat2 shRNA組小鼠大腦組織形態(tài)與正常小鼠大腦組織形態(tài)基本接近，可見少量神經(jīng)壞死細(xì)胞。研究結(jié)果表明，降低C2dat2表達(dá)可能可以減輕小鼠大腦損傷。lncRNAs是一類不具有編碼蛋白質(zhì)能力的RNA，屬于線性RNA[8-9]。lncRNAs參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、發(fā)育、防御以及免疫應(yīng)答系統(tǒng)等多種重要的生物行為過程[10]。lncRNAs在人類腫瘤中的作用研究最為深入，而在心腦血管疾病中的研究起步較晚。既往研究顯示，lncRNA-CARL通過抑制機(jī)體線粒體分裂和心肌細(xì)胞凋亡，從而降低腦缺血再灌注對(duì)神經(jīng)的損傷[11]。為進(jìn)一步分析C2dat2在MCAO/R模型小鼠中發(fā)揮的作用，本文進(jìn)行小鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，C2dat2 shRNA組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分明顯低于模型組和negative shRNA組，說明降低C2dat2表達(dá)可減輕MCAO/R對(duì)大腦神經(jīng)功能的損傷。既往研究顯示，腦梗死早期血清lncRNA XIST與急性腦梗死早期神經(jīng)功能缺損有關(guān)，可作為腦梗死潛在分子靶點(diǎn)[12]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，C2dat2 shRNA組細(xì)胞凋亡率顯著少于模型組，而模型組多于正常小鼠，提示MCAO/R可造成腦細(xì)胞大量死亡，減低C2dat2表達(dá)可有效抑制腦細(xì)胞壞死。C2dat2 shRNA組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和Belin 1表達(dá)水平明顯低于模型組；而模型組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和Belin 1表達(dá)水平高于假手術(shù)組。自噬是通過吞噬自身細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞器，體現(xiàn)細(xì)胞本身代謝需要和細(xì)胞器更新的過程[13]。在受損的細(xì)胞器激活細(xì)胞壞死或凋亡之前，適時(shí)清除受損的細(xì)胞器是一種重要的保護(hù)機(jī)制，以完成細(xì)胞自身的代謝需要和細(xì)胞器的更新，對(duì)于穩(wěn)定細(xì)胞正常的生長和代謝具有重要作用。人們發(fā)現(xiàn)自噬與神經(jīng)元損傷有關(guān)，發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用，而自噬又與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。近年來，自噬被認(rèn)為是除細(xì)胞壞死和凋亡之外的一種細(xì)胞死亡方式，但在大腦的缺血再灌注損傷中，適度自噬可以激發(fā)身體自我修復(fù)能力，有利于大腦的神經(jīng)損傷的修復(fù)，而當(dāng)自噬被過度激活后，則進(jìn)一步促進(jìn)受損腦神經(jīng)細(xì)胞死亡，加重病情發(fā)展[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，降低C2dat2表達(dá)可抑制機(jī)體自噬過度激活，減輕細(xì)胞壞死，起到保護(hù)大腦細(xì)胞的作用。

此外，C2dat2 shRNA組Caspase-3和p-p38MAPK表達(dá)水平明顯低于模型組；模型組Caspase-3和p-p38MAPK表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組。Caspase-3又稱為死亡蛋白酶，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，是凋亡的細(xì)胞內(nèi)途徑和細(xì)胞外途徑共同的下游效應(yīng)分子，也是細(xì)胞凋亡的必經(jīng)之路[16]。p38 MAPK信號(hào)通路可以在細(xì)胞外刺激下激活，激活的p38在炎癥、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[17]。當(dāng)腦梗死發(fā)生后，缺血區(qū)內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞中p38 MAPK的活性被激活，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程[18]。本研究結(jié)果說明，降低C2dat2的表達(dá)可抑制小鼠大腦細(xì)胞凋亡和自噬，其可能是通過抑制Caspase-3和p-p38MAPK表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，MCAO/R損傷程度與C2dat2的表達(dá)高低有關(guān)，降低C2dat2表達(dá)可減輕MCAO/R損傷，抑制大腦細(xì)胞凋亡和自噬，其可能與MAPK信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果尚存在一定的局限性，神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)的機(jī)制很復(fù)雜，往往是多方面因素共同作用的結(jié)果，需要大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。