何貝橋，高雅婷，梁 淼，梁麗娜，張園園*，王 波

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102400；2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院藥學部，寧夏 銀川 750000)

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)是與細胞增殖、分化和凋亡等過程密切相關的重要靶點[1]。其中，Ⅰ型PI3K(PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ)常被發(fā)現(xiàn)于多種實體瘤、淋巴腫瘤、炎癥及免疫疾病中[2-6]。目前，以PI3K為靶點的小分子抗腫瘤藥物主要包括廣譜型PI3K抑制劑(pan-PI3K inhibitors)、亞型特異性PI3K抑制劑(isoform-specific PI3K inhibitors)和PI3K/mTOR雙重抑制劑(dual PI3K and mTOR inhibitors)。作為第一個人工合成的廣譜型PI3K抑制劑LY294002，雖然不能應用于臨床，但其骨架和活性基團仍有被挖掘為新型高效低毒抑制劑的潛力[7-8]。

芹菜素(apigenin)是一種在自然界中含量非常豐富的黃酮類成分，在水果、蔬菜、藥用植物及紅酒中均有發(fā)現(xiàn)[9-11]。天然來源的芹菜素毒性低，具有抗腫瘤、抗菌和抗阿爾茨海默癥等藥理活性，其中抗腫瘤潛能尤為明顯[12]。同時，芹菜素擁有與LY294002類似的結構，且可經(jīng)PI3K/Akt通路抑制A549、HeLa細胞的增殖[13-14]。為解決芹菜素自身藥用的缺點和天然來源不足的問題，增強與PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ和PI3Kγ蛋白的親和力，作者設計合成芹菜素單糖苷，為其進一步開發(fā)為新型高效低毒的PI3K抑制劑提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

芹菜素(>97%)、超干N,N-二甲基甲酰胺(99.9%)、甲醇鈉(99%)、33%氫溴酸(33% in acetic acid)、碳酸銀(99%)、D-葡萄糖(>98%)、D-半乳糖(>98%)、D-阿拉伯糖(>98%)，北京伊諾凱科技有限公司；濃硫酸、乙酸酐(>96%)，Acros公司。

78-1型磁力攪拌器，常州榮華儀器制造有限公司；N-1300型旋轉蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；ASCEND-400型核磁共振儀，瑞士Bruker公司；柱層析硅膠(200～300目)，青島海洋化工廠。

1.2 目標化合物的合成路線

芹菜素的骨架與LY294002的核心骨架相似，且7位羥基活潑性最強。因此，在 7位引入不同的單糖基片段可明顯提高化合物的極性，改善溶解度；同時，由于糖基在藥物的轉運和靶向性中發(fā)揮著重要作用，設計的化合物與PI3K蛋白的親和力增強。目標化合物7-O-β-D-芹菜素葡萄糖苷的合成路線見圖1。

a:濃H2SO4，(CH3CO)2O，4 h b：33%HBr/AcOH，4 h c:芹菜素，Ag2CO3,DMF，24 h d:CH3ONa,CH3OH,4 h

1.3 合成方法

1.3.1 單糖的全乙?；?/p>

1.3.1.1 1,2,3,4,6-五-O-乙?；?α-D-吡喃葡萄糖(Ⅱ)的合成

量取16.0 mL乙酸酐于150 mL圓底燒瓶中，在冰浴條件下加入30.0 μL濃硫酸，低溫下分批加入4.00 g D-葡萄糖(Ⅰ,0.02 mol)；50 min后，在常溫下繼續(xù)反應190 min至反應完全；反應液用約60 mL二氯甲烷萃取3次，收集合并有機相，并依次用稀NaOH溶液、水、飽和NaCl溶液洗滌至中性，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，得到7.07 g無色糖漿狀液體化合物Ⅱ，產(chǎn)率為90.5%。

1.3.1.2 1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖的合成

將D-葡萄糖替換為D-半乳糖，合成方法同1.3.1.1，得到6.72 g無色糖漿狀液體1,2,3,4,6-五-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖，產(chǎn)率為86.0%。

1.3.1.3 1,2,3,4-四-O-乙酰基-α-D-呋喃阿拉伯糖的合成

將D-葡萄糖替換為D-阿拉伯糖，合成方法同1.3.1.1，得到8.61 g無色糖漿狀液體1,2,3,4-四-O-乙?；?α-D-吡喃阿拉伯糖，產(chǎn)率為90.2%。

1.3.2 溴代

1.3.2.1 2,3,4,6-四-O-乙?；?α-D-溴代吡喃葡萄糖(Ⅲ)的合成

將化合物Ⅱ(7.07 g,0.02 mol)溶于10 mL二氯甲烷中，加入33%HBr/AcOH溶液4 mL，室溫反應4 h，TLC監(jiān)測反應進程。反應完全后，將反應液分散于8 mL冰水中，并用10 mL二氯甲烷萃取3次，收集合并有機相，依次用稀NaOH溶液、冰水洗滌至中性；無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，經(jīng)石油醚-乙酸乙酯(4∶1，體積比，下同)柱層析,得到7.76 g無色糖漿狀液體化合物Ⅲ，產(chǎn)率為94.4%。

1.3.2.2 2,3,4,6-四-O-乙?；?α-D-溴代吡喃半乳糖的合成

將化合物Ⅱ替換為1,2,3,4,6-五-O-乙?；?α-D-吡喃半乳糖，合成方法同1.3.2.1，得到5.52 g無色糖漿狀液體2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-溴代吡喃半乳糖，產(chǎn)率為79.0%。

1.3.2.3 2,3,4-三-O-乙酰基-α-D-溴代吡喃阿拉伯糖的合成

將化合物Ⅱ替換為1,2,3,4-四-O-乙?；?α-D-吡喃阿拉伯糖，合成方法同1.3.2.1，得到8.07 g無色糖漿狀液體2,3,4-三-O-乙?；?α-D-溴代吡喃阿拉伯糖，產(chǎn)率為88.0%。

1.3.3 芹菜素7位單糖苷衍生物的合成

1.3.3.1 7-O-β-D-芹菜素葡萄糖苷(Ⅴ)的合成

將芹菜素(0.11 g，0.40 mmol)溶于8 mL DMF中，加入化合物Ⅲ6 mL、碳酸銀(0.33 g，1.20 mmol)避光反應24 h；每隔12 h加入6 mL化合物Ⅲ；24 h后，過濾碳酸銀，水洗DMF，經(jīng)石油醚-乙酸乙酯(9∶5)柱層析,得到0.15 g黃色固體化合物Ⅳ7-O-β-D-芹菜素乙酰葡萄糖苷，產(chǎn)率為62.5%。

將化合物Ⅳ(0.15 g，0.25 mmol)溶于15 mL甲醇中，加入適量甲醇鈉至pH值為 9～10，室溫反應4 h；然后加入適量陽離子樹脂使反應體系呈中性，過濾，經(jīng)乙酸乙酯-甲醇(5∶1)柱層析,得到0.10 g淡黃色固體化合物Ⅴ，產(chǎn)率為90.9%。

1.3.3.2 7-O-β-D-芹菜素半乳糖苷的合成

將化合物Ⅲ替換為2,3,4,6-四-O-乙?；?α-D-溴代吡喃半乳糖，合成方法同1.3.3.1，得到0.08 g淡黃色固體7-O-β-D-芹菜素半乳糖苷，產(chǎn)率為84.2%。

1.3.3.3 7-O-β-D-芹菜素阿拉伯糖苷的合成

將化合物Ⅲ替換為2,3,4-三-O-乙?；?α-D-溴代吡喃阿拉伯糖，合成方法同1.3.3.1，得到0.11 g淡黃色固體7-O-β-D-芹菜素阿拉伯糖苷，產(chǎn)率為91.7%。

1.4 分子對接

選擇PI3Kα蛋白(PDB：4jps)、PI3Kβ蛋白(PDB：4bfr)、PI3Kγ蛋白(PDB：5g2n)和PI3Kδ蛋白(PDB：5ngb)作為研究對象，依次提取蛋白中的原始配體，利用原始配體確定分子對接的活性位點并驗證對接的準確性。利用AutoDock Vina軟件分別將預處理好的蛋白與配體進行分子對接。

2 結果與討論

2.1 目標化合物的表征

7-O-β-D-芹菜素葡萄糖苷：1HNMR(400 MHz,DMSO-d6)，δ：12.96(s,1H,OH-5),10.32(s,1H,OH-4′),7.95(d,J=8.6 Hz,2H,H-2′,H-6′),6.96(d,J=8.7 Hz,2H,H-3′,H-5′),6.85(s,1H,H-3),6.84～6.82(m,1H,H-8),6.44(d,J=1.9 Hz,1H,H-6),5.07(d,J=7.4 Hz,1H,H-1″),4.22(t,J=6.6 Hz,1H,OH-2″),3.51～3.43(m,4H,H-2″,OH-3″,4″,6″),3.36～3.24(m,5H,H-3″,4″,5″,6″)；13CNMR(101 MHz,DMSO-d6),δ:182.08(C=O),167.06(C-7),164.41(C-2),163.06(C-O),161.63(C5-OH),157.04(C-4′),128.67(C-2′,C-6′),121.00(C-1′),116.14(C-3,C-5′),105.43(C-3),103.14(C-(C5-OH)),100.02(C-1″),99.62(C-6),94.94(C-8),77.26(C-2″),73.21(C-3″),69.65(C-5″),65.11(C-4″),60.69(C-6″)；ESI-MS，m/z:433.112 95[M+H]+。

7-O-β-D-芹菜素半乳糖苷：1HNMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:12.96(s,1H,OH-5),10.41(s,1H,OH-4′),7.95(d,J=8.8 Hz,2H,H-2′,H-6′),6.94(d,J=8.8 Hz,2H,H-3′,H-5′),6.86(s,1H,H-3),6.82(d,J=2.1 Hz,1H,H-8),6.45(d,J=2.1 Hz,1H,H-6),6.20(d,J=2.0 Hz,1H,H-1″),5.28～5.22(m,1H,OH-4″),5.02(d,J=7.7 Hz,1H,OH-3″),4.71(d,J=5.0 Hz,1H,OH-2″),4.56(d,J=4.6 Hz,1H,OH-6″),3.70～3.67(m,2H,H-2″,H-3″),3.67～3.53(m,4H,H-4″,H-5″,H-6″);13CNMR(101 MHz,DMSO-d6),δ:182.09(C=O),164.34(C-7),163.17(C5-OH),161.46(C-O),157.04(C-4′),128.70(C-2′,C-6′),121.13(C-1′),116.10(C-3′,C-5′),105.38(C-3),103.20(C-1″),100.60(C-(C5-OH)),99.58(C-6),94.89(C-8),75.81(C-5″),73.26(C-3″),70.15(C-2″),68.17(C-4″),60.38(C-6″);ESI-MS,m/z:433.113 04[M+H]+。

7-O-β-D-芹菜素阿拉伯糖苷:1HNMR(400 MHz,DMSO-d6),δ:12.95(s,1H,OH-5),10.39(s,1H,OH-4′),7.96(d,J=8.7 Hz,2H,H-2′,H-6′),6.94(d,J=8.7 Hz,2H,H-3′,H-5′),6.86(s,1H,H-3),6.81(d,J=1.7 Hz,1H,H-8),6.41(d,J=1.8 Hz,1H,H-6),5.30(d,J=5.1 Hz,1H,H-1″),5.04(d,J=6.8 Hz,2H,OH-2″,OH-4″),4.89(d,J=5.6 Hz,1H,OH-3″),4.70(d,J=3.9 Hz,1H,H-2″),3.75～3.62(m,4H,H-3″,H-4″,H-5″);13CNMR(101 MHz,DMSO-d6),δ:182.10(C=O),164.35(C-7),162.91(C5-OH),161.19(C-O),157.07(C-4′),128.74(C-2′,C-6′),121.13(C-1′),116.09(C-3′,C-5′),105.38(C-3),103.17(C-1″),100.29(C-(C5-OH)),99.58(C-6),94.75(C-8),72.45(C-2″),70.13(C-3″),67.56(C-4″),65.99(C-5″);ESI-MS,m/z:403.102 14[M+H]+。

2.2 分子對接結果

目標化合物與PI3K蛋白的結合能見表1，目標化合物與PI3K蛋白的對接結果見表2。

表1 目標化合物與PI3K蛋白的結合能/(kcal·mol-1)

表2 目標化合物與PI3K蛋白的對接結果

由表1可知，目標化合物與PI3K蛋白的結合能(-10.0～-8.4 kcal·mol-1)均明顯低于芹菜素，與陽性對照LY294002相當。由表2可知，目標化合物在活性口袋中與更多氨基酸形成氫鍵和疏水作用。

2.3 討論

在藥物設計方面，LY294002的結構與黃酮類相似，提示黃酮類有被開發(fā)為新型PI3K抑制劑的潛能。同時，芹菜素具有來源豐富、毒性低和抗腫瘤作用明顯等優(yōu)勢，是設計為新型高效低毒PI3K抑制劑的良好先導化合物。糖基化修飾既可改善芹菜素本身的溶解度，也能增強目標化合物與PI3K蛋白的親和力，提高活性。在合成方面，利用Koenigs-Knorr法合成了7-O-β-D-芹菜素葡萄糖苷、7-O-β-D-芹菜素半乳糖苷和7-O-β-D-芹菜素阿拉伯糖苷，反應條件溫和，操作簡單，為芹菜素單糖苷的進一步研究提供物質基礎。

在親和力研究方面，綜合考慮結合能、氫鍵和疏水作用，目標化合物與PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ蛋白的親和力均高于芹菜素的。其中，目標化合物對PI3Kβ蛋白的親和力稍弱于其它蛋白，這可能與PI3Kβ蛋白活性位點的氨基酸有關。

3 結論

基于廣譜型PI3K抑制劑LY294002的結構，以芹菜素為母核，設計合成了3個目標化合物7-O-β-D-芹菜素葡萄糖苷、7-O-β-D-芹菜素半乳糖苷和7-O-β-D-芹菜素阿拉伯糖苷，結構經(jīng)1HNMR、13CNMR和ESI-MS表征；并通過分子對接研究了目標化合物與PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ蛋白的親和力。目標化合物與PI3K蛋白的親和力均高于芹菜素的。設計合成的3個目標化合物有被進一步開發(fā)為PI3K抑制劑的潛力。