吳嶼碩，閻維巍，張鑫楠，葛永紅，賈曉輝

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121013）

（2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所）

梨是我國主要果樹樹種，其栽培面積和產(chǎn)量均居世界第1 位。2018 年我國梨的栽培面積達(dá)94.34萬hm2，占全國水果種植面積的7.94%；2018 年我國梨的產(chǎn)量達(dá)1 607.8 萬t，占全國水果總產(chǎn)量的6.26%[1]。然而，近年來在我國梨貯藏企業(yè)中發(fā)現(xiàn)的新病害——立枯絲核菌果腐病（Rhizoctonia solani），對貯藏企業(yè)造成了潛在的威脅。

R.solani是絲核菌屬中最復(fù)雜、最龐大的多核絲核菌[2]。其無性態(tài)屬于無孢目絲核菌屬，有性態(tài)為擔(dān)子菌門瓜亡革菌[3]。一般在田間多為無性態(tài)，其寄主范圍極廣，至少可侵染263 種植物，包括水稻、玉米、大豆、馬鈴薯等[4-7]。據(jù)報(bào)道，該病原菌可引起草莓根腐病[8]、西瓜立枯病[9]、甜瓜果腐病[10]、煙草靶斑病[11]、馬鈴薯黑痣病[12]、水稻紋枯病[13]、玉米紋枯病[14]、甘藍(lán)黑根病[15]、娃娃菜褐腐病[16]、蕎麥立枯病[17]、棉花立枯病[18]等。迄今為止，關(guān)于立枯絲核菌果腐病菌生長條件尚未見系統(tǒng)研究，該病原菌是否能侵染其他樹種果實(shí)也不明確。

因此，本研究以R.solani為對象，探討離體條件下不同培養(yǎng)基、溫度、pH 值、光照條件、碳源、氮源對其生長特性的影響，同時(shí)研究R.solani對不同寄主的致病力，以期為進(jìn)一步研究立枯絲核菌果腐病發(fā)病機(jī)理及其合理有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試菌株。從自然腐爛的梨果實(shí)病健交界處分離R.solani，純化鑒定后低溫保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）上。使用前將保存的菌株從4 ℃左右的冰箱取出后，挑取少量菌絲接種至PDA 平板上，在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落直徑達(dá)平皿的2/3 時(shí)，用直徑為5 mm 的打孔器打取菌餅，接種至用酒精消毒后的黃冠梨表面，置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)第5 d，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌，并進(jìn)行純化，獲得復(fù)壯菌株，備用。

（2）供試培養(yǎng)基。PDA、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Saccharose Agar，PSA）、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（Plate Count Agar，PCA）、燕麥粉培養(yǎng)基（Oatmeal Agar，OA）、察氏培養(yǎng)基（Czapek-Dox Medium）、梨汁培養(yǎng)基（馬鈴薯粉20 g，瓊脂粉18 g，過濾黃冠梨純梨汁1 000 mL）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長和菌核形成的影響

將供試培養(yǎng)基高溫滅菌后，各取10 mL，倒入直徑為90 mm 的培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻備用。用內(nèi)徑為5 mm 的打孔器打取同一菌齡的菌餅，轉(zhuǎn)接至不同培養(yǎng)基平板上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中全光照培養(yǎng)。每天觀察菌落生長情況，3 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)5 次，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)平板。計(jì)算不同培養(yǎng)基中R.solani菌絲生長速率，并在培養(yǎng)20 d 后觀察菌核形成情況。

1.2.2 不同溫度對菌絲生長和菌核形成的影響

用打孔器打取直徑為5 mm 的菌餅接種至PDA培養(yǎng)基平板中央位置，分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，采用全光照模式，培養(yǎng)3 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)5 次，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)平板。觀察菌絲生長情況，并計(jì)算不同溫度下R.solani菌絲生長速率，并在培養(yǎng)20 d 后觀察菌核形成情況。

1.2.3 不同pH 值對菌絲生長和菌核形成的影響

用1 mol/L 稀鹽酸或1 mol/L NaOH 溶液將PDA培養(yǎng)基調(diào)至所需pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），滅菌后取10 mL 倒入培養(yǎng)皿中，用打孔器打取直徑5 mm 的菌餅接種至PDA 培養(yǎng)基平板中央，用封口膜密封后在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中全光照培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況，培養(yǎng)3 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)5 次，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)平板。計(jì)算不同pH 值條件下R.solani菌絲生長速率，并在培養(yǎng)20 d 后觀察菌核形成情況。

1.2.4 不同光照對菌絲生長和菌核形成的影響

用打孔器打取直徑為5 mm 的菌餅接種至PDA培養(yǎng)基平板中央位置，用封口膜密封后在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別置于全光照（光照∶黑暗＝24 h∶0 h）、全黑暗（光照∶黑暗＝0 h∶24 h）、光暗交替（光照∶黑暗＝12 h∶12 h）環(huán)境中，隔天觀察菌落生長情況，培養(yǎng)3 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)5 次，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)平板。計(jì)算不同光照中R.solani菌絲生長速率，并在培養(yǎng)20 d 后觀察菌核形成情況。

1.2.5 不同碳源對菌絲生長和菌核形成的影響

用打孔器打取直徑為5 mm 的菌餅接種至以果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、淀粉、麥芽糖和木糖為碳源的PDA 培養(yǎng)基平板中央位置，用封口膜密封后在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中全光照培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)5 次，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)平板。計(jì)算不同碳源中R.solani菌絲生長速率，并在培養(yǎng)20 d 后觀察菌核形成情況。

1.2.6 不同氮源對菌絲生長和菌核形成的影響

用打孔器打取直徑為5 mm 的菌餅接種至以0.5%的氯化銨、硫酸銨、甘氨酸、磷酸二氫銨、硝酸銨、硝酸鉀和谷氨酸為氮源的PDA 培養(yǎng)基平板中央位置，用封口膜密封后在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中全光照培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)5 次，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)平板。計(jì)算不同氮源中R.solani菌絲生長速率，并在培養(yǎng)20 d后觀察菌核形成情況。

1.2.7 寄主范圍測定

按照柯赫氏法則，采用有傷接種方式進(jìn)行離體果實(shí)致病性測定。選取大小一致、無機(jī)械傷、病蟲害的梨、蘋果、香蕉、藍(lán)莓、葡萄、橙、獼猴桃、桃、李、棗共10 個(gè)樹種的12 個(gè)品種果實(shí)各30 個(gè)，經(jīng)70%的酒精表面消毒后用無菌水沖洗，自然晾干后備用。取在PDA 上培養(yǎng)5 d 的菌餅，菌絲面向下直接接種至果實(shí)胴部位置；以PDA 圓餅直接接種至果實(shí)胴部位置作為對照。將處理好的果實(shí)放在密封塑料袋中，然后將其置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察病斑擴(kuò)展情況，第10 d 測定病斑直徑。將發(fā)病部位進(jìn)行常規(guī)組織分離，通過形態(tài)學(xué)鑒定是否為接種菌種。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌離體生長條件

2.1.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長和菌核形成的影響

由表1 可知，R.solani在6 種培養(yǎng)基中均能生長，其中在察氏培養(yǎng)基上生長速率最快，培養(yǎng)3 d時(shí)生長速率為24.70 mm/d，且濃密；在PCA 培養(yǎng)基上菌絲生長也較快，但與察氏培養(yǎng)基上相比較稀疏；在梨汁培養(yǎng)基上菌絲生長較慢?？梢娫? 種培養(yǎng)基中，察氏培養(yǎng)基為R.solani生長的最適培養(yǎng)基。

表1 不同培養(yǎng)基對R.solani 菌絲生長的影響

由圖1 可知，R.solani菌核在6 種培養(yǎng)基中均能形成，在PDA 培養(yǎng)基上形成菌核數(shù)量最多，其次是OA 培養(yǎng)基，而PSA 培養(yǎng)基和PCA 培養(yǎng)基不利于菌核的形成。因此，適合R.solani菌核生長的培養(yǎng)基順序是PDA 培養(yǎng)基＞OA 培養(yǎng)基＞察氏培養(yǎng)基＞梨汁培養(yǎng)基＞PCA 培養(yǎng)基＞PSA 培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基對R.solani 菌核的影響

2.1.2 不同溫度對菌絲生長和菌核形成的影響

由表2 可知，R.solani菌絲在5～10 ℃條件下不生長；在15～35 ℃條件下均能生長，各溫度之間均存在顯著性差異，生長速率依次為25 ℃＞30 ℃＞20 ℃＞15 ℃＞35 ℃，25 ℃時(shí)菌絲濃密。因此，R.solani生長最適溫度為25 ℃。

表2 不同溫度對R.solani 菌絲生長的影響

從圖2 可以看出，溫度對R.solani菌核形成有一定的影響，在15～35 ℃條件下均可形成菌核，并隨著溫度的升高，菌核形成數(shù)量增加，但35 ℃時(shí)菌核明顯減少。因此，25～30 ℃培養(yǎng)有利于R.solani形成菌核且數(shù)量較多。

圖2 不同溫度對R.solani 菌核的影響

2.1.3 不同pH 值對菌絲生長和菌核形成的影響

由表3 可知，在pH 值4.0～10.0 范圍內(nèi)R.solani菌絲均能生長，在培養(yǎng)3 d 時(shí)，pH 值5.0～6.0 培養(yǎng)基中菌落直徑顯著高于其他pH 值條件，且菌絲濃密。當(dāng)pH 值小于5.0 時(shí)，菌落直徑隨pH 值的降低而減小。當(dāng)pH 值大于6.0 時(shí)，菌落直徑隨pH 值的增大而減小。因此，R.solani生長的最適宜pH 值為5.0～6.0。

表3 不同pH 值對R.solani 菌絲生長的影響

從圖3 可以看出，R.solani菌核在pH 值4.0～10.0 范圍內(nèi)均能形成，并且在pH 值5.0～7.0 條件下隨著pH 值升高菌核數(shù)量逐漸增加，但pH 值達(dá)到8.0 時(shí)菌核數(shù)量明顯減少。因此，pH 值為5.0～7.0 時(shí)利于R.solani形成菌核且數(shù)量較多。

圖3 不同pH 值對R.solani 菌核的影響

2.1.4 不同光照對菌絲生長和菌核形成的影響

由表4 可知，R.solani菌絲在3 種光照條件下均能生長，其中全光照條件最適宜病原菌生長。在培養(yǎng)3 d 時(shí)，菌落直徑可達(dá)70.00 mm，顯著高于光暗交替和全黑暗條件，菌絲生長快且濃密。因此，R.solani菌絲生長最適光照條件為全光照。

表4 不同光照對R.solani 菌絲生長的影響

如圖4 所示，R.solani在不同光照條件下均可形成菌核，在全光照條件下產(chǎn)生的菌核數(shù)量最多，并且顏色較深；其次是全黑暗條件；而在12 h 光照/12 h 黑暗條件下產(chǎn)生的菌核數(shù)量較少，且生長較分散。因此，全光照可以促進(jìn)R.solani菌核的形成。

圖4 不同光照對R.solani 菌核的影響

2.1.5 不同碳源對菌絲生長和菌核形成的影響

由表5 可知，R.solani在含有不同碳源的7 種培養(yǎng)基中均能生長，但生長速率不同，在麥芽糖作為碳源的培養(yǎng)基上生長最快，培養(yǎng)3 d 時(shí)菌落直徑為78.00 mm；在淀粉作為碳源的培養(yǎng)基上生長較快，菌落直徑為77.00 mm；在含有不同碳源的7 種培養(yǎng)基中，相對不利于病原菌生長的碳源是乳糖，菌落直徑為40.00 mm。因此，R.solani生長的最適碳源為麥芽糖。

表5 不同碳源對R.solani 菌絲生長的影響

由圖5 可知，以果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、淀粉、麥芽糖作為碳源，菌核均在中央形成，但數(shù)量未見明顯差異；木糖作為碳源，菌核在距離中心較遠(yuǎn)處形成。由此說明，R.solani菌核形成與碳源的關(guān)系不密切。

圖5 不同碳源對R.solani 菌核的影響

2.1.6 不同氮源對菌絲生長和菌核形成的影響

由表6 可以看出，R.solani在含有不同氮源的7種培養(yǎng)基中均能生長，在甘氨酸作為氮源的培養(yǎng)基上生長較快，生長速率為19.83 mm/d，培養(yǎng)3 d 時(shí)菌落直徑為59.50 mm；在含有不同氮源的7 種培養(yǎng)基中，相對不利于病原菌菌絲生長的氮源是氯化銨，培養(yǎng)3 d 時(shí)菌落直徑僅10.90 mm。因此，R.solani生長的最適氮源為甘氨酸。

表6 不同氮源對R.solani 菌絲生長的影響

由圖6 可知，不同氮源與R.solani菌核形成量有一定關(guān)系。氯化銨作為氮源時(shí)，菌核形成較多；谷氨酸作為氮源時(shí)，無明顯菌核形成。因此，適合R.solani菌核形成的氮源依次為氯化銨＞硝酸銨＞硫酸銨＞硝酸鉀＞甘氨酸＞磷酸二氫銨＞谷氨酸。

圖6 不同氮源對R.solani 菌核的影響

2.2 寄主范圍測定

由表7 可知，R.solani除了可侵染梨果實(shí)外，還可侵染蘋果、香蕉、桃、李、棗等果實(shí)，但不侵染藍(lán)莓、葡萄、橙和獼猴桃果實(shí)。R.solani對梨的侵染能力最強(qiáng)，接種到梨上的病斑直徑基本顯著高于其他樹種，并且對不同梨品種的侵染能力差異顯著，其中，早酥和黃冠梨接種后病斑直徑顯著高于三季梨；對不同蘋果品種的侵染能力同樣差異顯著，秋香蘋果接種后病斑直徑顯著高于富士蘋果。

表7 R.solani 寄主范圍測定

將發(fā)病部位進(jìn)行常規(guī)組織分離，培養(yǎng)物通過形態(tài)學(xué)鑒定與供試菌株特性一致，證實(shí)發(fā)病部位是由R.solani侵染所導(dǎo)致。

3 討論與結(jié)論

已有研究認(rèn)為，立枯絲核菌（R.solani）是最具破壞力的植物病原菌之一[19]。其引起的根腐病于1904 年最早在美國煙草植株上報(bào)道[20]。目前，進(jìn)一步明確其寄主范圍廣、危害大，主要危害禾本科、茄科、豆科和十字花科等43 科260 多種植物[21]。本研究表明，R.solani除可侵染梨果實(shí)外，還可侵染蘋果、香蕉、桃、李、棗等果實(shí)。本研究采用無傷接種方式進(jìn)行致病性試驗(yàn)，可見，R.solani對上述果實(shí)具有較強(qiáng)的侵染能力。而對不同蘋果、梨品種間的致病力仍存在較大差異，在黃冠梨及秋香蘋果果實(shí)上致病力較強(qiáng)，說明選擇抗病品種是防控該病害發(fā)生的有效途徑。

本研究表明，R.solani菌絲生長最適培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基。這與洪愷等[22]研究發(fā)現(xiàn)遼寧花生R.solani引起的基腐病結(jié)果不一致?？赡苁怯捎谠摬≡募闹鞑煌瑢?dǎo)致的結(jié)果不同，并且與PDA 培養(yǎng)基中來自馬鈴薯的氮源不同的是本研究中察氏培養(yǎng)基的氮源為硝酸鹽。根據(jù)上述研究結(jié)果可知，R.solani菌絲在硝酸鹽作為氮源的條件下，生長較好；R.solani菌核形成最適培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，可能是由于PDA 培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖，而察氏培養(yǎng)基中的碳源為果糖。R.solani菌絲在15～30 ℃溫度范圍內(nèi)均可快速生長，并且大豆根腐病中的R.solani在15～30 ℃溫度范圍內(nèi)生長較快[23]；R.solani在15～30 ℃溫度范圍內(nèi)均可形成菌核，小麥紋枯病中的R.solani在15～30 ℃溫度范圍內(nèi)有菌核形成，并且溫度在25～30 ℃條件下最有利于形成菌核且數(shù)量較多、個(gè)體較大[24]。R.solani菌絲在pH 值為5.0～6.0 范圍內(nèi)生長良好，pH 值為6.0 時(shí)菌絲生長速度最快且菌核形成較多。R.solani菌絲在PDA 培養(yǎng)基上于25 ℃、全光照培養(yǎng)條件下平均生長速率為22.50 mm/d，屬于已有真菌中生長速度較快的病原菌。R.solani生長速度快的特性意味著該病原菌具有較好的適應(yīng)能力，加大了梨果腐病病害的防控難度。全光照培養(yǎng)的R.solani菌絲生長最快，這與王文慧等[24]研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯R.solani引起的黑痣病結(jié)果不一致，馬鈴薯黑痣病中的R.solani屬于AG-3，可能是由于梨果腐病中該病原菌的菌絲融合群與馬鈴薯黑痣病的菌絲融合群不同導(dǎo)致；且在全光照條件下菌核形成數(shù)量較多，小麥紋枯病中的R.solani在全光照條件下產(chǎn)生的菌核數(shù)量最多[25]。在不同碳源、氮源培養(yǎng)基上，該病原菌的生長有所差異。以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基最適合病菌生長和菌核形成；以甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基病菌生長最快，且菌核形成數(shù)量較多，對于煙草靶斑病中的R.solani菌絲生長及菌核形成，甘氨酸是較好的氮源[26]。R.solani病原菌在自然界中存在一定的遺傳多樣性，是否存在致病性分化，還有待于進(jìn)一步研究。