安常蓉，李 蕓，劉昌閎，崇慧影，文光琴，聶 飛，段如雁

（1 貴州省生物研究所，貴陽550009）

（2 貴州省植物園）

藍(lán)莓，也稱越橘，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生灌木果樹，是新興的經(jīng)濟(jì)林樹種之一[1]。藍(lán)莓含有豐富的多種維生素、糖類、酸類以及多種礦質(zhì)元素，具有多種食療保健功效，因此被營養(yǎng)學(xué)家稱為“21 世紀(jì)功能性保健漿果”，同時也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的人類五大健康食品之一[2]。

藍(lán)莓的根系沒有根毛，根系結(jié)構(gòu)簡單，對水分和養(yǎng)分的吸收主要依賴于與其共生的菌根真菌[3]。1911 年，Coville[4]首先觀察到高叢藍(lán)莓根系中有菌根真菌寄生，并推測菌根真菌的侵染可能對藍(lán)莓生長有益。尤其是近20 年來對藍(lán)莓菌根的研究已成為熱點(diǎn)，更多研究表明，接種菌根真菌可以促進(jìn)藍(lán)莓對土壤中礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收，促進(jìn)植株生長，同時還調(diào)節(jié)植株自身內(nèi)部的代謝活性，增強(qiáng)植株的抗性，提高藍(lán)莓的產(chǎn)量等[5-11]。亦有研究表明，接種菌根真菌對宿主植物的生長并沒有起到促進(jìn)作用，接種內(nèi)生真菌后宿主植物生長停滯、成活率降低等[12]。因此，接種后是否有促進(jìn)效果受到多方面因素的影響，如植株因素、菌物因素等。對此，找出適合藍(lán)莓無性繁殖苗生長的共生菌根是有研究意義的。本文以1 年生藍(lán)莓無菌組培苗為研究材料，接種從栽培藍(lán)莓植株根系上分離純化的內(nèi)生菌株菌液，通過定期監(jiān)測苗木的生長，于生長旺期測定生理生化指標(biāo)，生長結(jié)束期采集根系觀察侵染情況，并采集植株測定生物量，最終初步篩選出適合藍(lán)莓生長的菌株，這對于生產(chǎn)實(shí)踐中藍(lán)莓高效栽培具有理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試菌株。從畢節(jié)赫章和花溪高坡兩地采集不同栽培品種藍(lán)莓植株的根系，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，將根系上土壤洗凈，用75%酒精浸泡1 min，然后用1‰HgCl2浸泡10 min，取其幼根，在無菌條件下，用經(jīng)過消毒的剪刀剪成長0.5 cm 的根段，選用PDA 培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿中放置6 個根段，后將培養(yǎng)皿倒置在培養(yǎng)箱內(nèi)，25 ℃避光培養(yǎng)。待培養(yǎng)基長出菌落后再用接種環(huán)挑取無污染的菌落繼續(xù)在PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至得到單一菌株。純化的菌株通過rDNA-ITS 全序列分析，對6 個菌株進(jìn)行分子鑒定。

（2）供試植株。選擇生長一致的1 年生藍(lán)莓無菌組培苗，品種為萊克西。

（3）栽培基質(zhì)。栽培基質(zhì)為泥炭、草炭和珍珠巖等量混合，栽植前于121 ℃高壓滅菌2 h。

（4）栽培容器。外口徑14.5 cm、內(nèi)口徑13.5 cm、高12.5 cm 和底徑10.2 cm 的塑料花盆于0.1%高錳酸鉀溶液中浸泡消毒0.5 h。

1.2 方法

供試菌株在PDA 培養(yǎng)基上純化后，接入PDB液體培養(yǎng)基上，于25 ℃下?lián)u床培養(yǎng)7 d 左右。無菌組培苗種植5 個月后，將培養(yǎng)好的菌液澆灌藍(lán)莓苗根部，以不澆菌液為對照（CK），每株苗木澆灌50 mL，每個處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)10 株苗，隔5 d 澆無菌水，其間不施加任何肥料。澆菌液前測定每株藍(lán)莓苗的苗高、地徑（地徑是苗干靠近基質(zhì)處的直徑，在測量之前先標(biāo)記好，便于后面的測量），以后每隔30 d 測1 次，連續(xù)監(jiān)測5 個月。選擇持續(xù)向好的晴天，選擇苗木位置相同并充分展開的5 株標(biāo)準(zhǔn)株功能葉片，測定藍(lán)莓苗木的快速光響應(yīng)指標(biāo)和光譜效應(yīng)指標(biāo)，并采集葉片測定葉綠素含量。苗木生長結(jié)束后，選取每個處理10 株藍(lán)莓植株的生活根連帶部分根際土帶回實(shí)驗(yàn)室，迅速清除根系表面的土粒和雜物，在自來水下沖洗干凈，放在已編號的包埋盒里，用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，放入10%KOH溶液中，將其置于90 ℃水浴鍋中3 h，期間再換1次10%KOH 溶液，再通過一系列的染色、分色和制片過程后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌根的侵染特征并拍照記錄，同時采集植株根系測定根系活力、生物量等指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)的測定

（1）苗高、地徑的測量。用卷尺（精度0.1 cm）測量苗高，用游標(biāo)卡尺（精度0.01 mm）測量地徑。

（2）生物量的測定。計(jì)算每個處理植株的平均地徑和平均苗高，按平均地徑和平均苗高±5%選取5 株標(biāo)準(zhǔn)株，采集植株前先把每株的所有葉片收集好，洗凈擦干后把根和莖（做好標(biāo)記點(diǎn)以下的根系為根重，其余部分為莖重）分開，且分裝在不同的牛皮信封紙袋中，后放入105 ℃烘箱中殺青30 min，再用80 ℃烘至恒重，并稱量根、莖、葉各部分的干重。

（3）侵染率的計(jì)算。經(jīng)染色的根段在乳酸甘油中脫色后，用剪刀剪取粗細(xì)均勻、長度約1 cm 的根段放在干凈的載玻片上，每個載玻片放5 個根段，加蓋干凈的蓋玻片，將壓片放在顯微鏡下進(jìn)行觀察，每個處理放置8 個載玻片觀察。在觀察中，能夠觀察有菌絲的根段記為侵染的根段，相反，沒有觀察到任何菌絲侵染的根段為無侵染的根段。

侵染率（%）=（侵染的根段數(shù)/鏡檢根段總數(shù)）×100

（4）葉片光譜的測定。選擇持續(xù)向好的天氣，使用CI-710 光譜儀測定苗木位置相同并充分展開的5 株標(biāo)準(zhǔn)株功能葉片在400～1 000 nm 波長范圍內(nèi)的透射率、吸收率和反射率參數(shù)，每個處理測定3 次，取平均值。分析全部葉片測定的吸收、透射和反射的光譜曲線，發(fā)現(xiàn)固定波長范圍內(nèi)在470、550、670、780、880 nm 處有吸收峰，峰值波長漂移范圍較窄，一般在±5 nm 內(nèi)。因此選擇波長位置位于470、550、670、780、880 nm 處的吸收光譜、透射光譜、反射光譜作為特征光譜變量。

（5）葉片光響應(yīng)參數(shù)的測定。選擇持續(xù)向好的晴天，用Junior-PAM 葉綠素?zé)晒鈨x測定PAR（光合有效輻射）和ETR（相對電子傳遞速率）等，對曲線進(jìn)行擬合后得到光能利用效率（α）、最大電子傳遞速率（ETRm）以及最小飽和光強(qiáng)（Ik）3 個主要參數(shù)。

（6）生理生化指標(biāo)的測定。參照文獻(xiàn)［13］，葉綠素含量的測定采用丙酮乙醇等比混合液法，根系活力的測定采用TTC 法。

1.4 綜合評價法的確定

由于各指標(biāo)的單位、性質(zhì)和數(shù)量的不同，故采用模糊數(shù)學(xué)隸屬度函數(shù)對各項(xiàng)指標(biāo)測定值進(jìn)行定量轉(zhuǎn)換[14]。即f（Xi）=（Xij-Ximin）/（Ximax-Ximin）和f（Xi）=（Ximax-Xij）/（Ximax-Ximin），其中f（Xi）為各指標(biāo)隸屬度，Xij 表示各指標(biāo)值，Ximax和Ximin 分別表示第i 項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值。將各處理的隸屬函數(shù)值求和，數(shù)值越大則綜合評價越高，并對不同處理的數(shù)值求和進(jìn)行排序。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖，采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行分析處理，采用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 通過ITS 序列分析的6 株菌株

通過鑒定分析，6 株菌株中有1 株藍(lán)狀菌屬，4株青霉素，1 株枝孢屬。其中，1 號菌株的最相似種為棘狀踝節(jié)菌，相似度為99.82%。2～5 號菌株雖然是同屬青霉素，但最相似種不同，2 號菌株的最相似種為柑橘青霉菌種，相似度為100.00%；3 號和5 號菌株最相似種為青霉菌種，相似度均為100.00%；4 號菌株的最相似種為油菜青霉菌種，相似度為99.81%。6 號菌株的最相似種為枝孢菌種，相似度為100.00%（表1）。

表1 通過ITS 序列分析的6 株菌株

2.2 接種不同菌株的藍(lán)莓根系侵染特征及侵染率

通過臺盼藍(lán)染色法對所有藍(lán)莓根系進(jìn)行顯微觀察發(fā)現(xiàn)，侵染主要發(fā)生在根系為黃棕色的根段部分，菌絲的形態(tài)是由較粗的菌絲組成的密致的團(tuán)狀，細(xì)胞被菌絲充滿。從表2 可以看出，接種不同內(nèi)生真菌處理的藍(lán)莓根系均觀察到有侵染現(xiàn)象，且與CK相比差異顯著。其中，2 號菌株的侵染率最高，達(dá)57.5%；其次是1 號和4 號，侵染率均為52.5%；5號菌株的侵染率最低，為45.0%。6 個菌株處理的藍(lán)莓根系侵染率分別是CK 的4.2、4.6、4.0、4.2、3.6、3.8 倍。由此可見，沒有接種菌液的CK 雖然有侵染，但人工接種菌液處理的侵染率顯著高于CK。

表2 接種6 個菌株的藍(lán)莓根系侵染率

2.3 接種不同菌株對藍(lán)莓苗生長的影響

2.3.1 苗高和地徑

從表3 可以得知，人工接種菌液促進(jìn)藍(lán)莓苗高生長。與CK 相比，1 號、2 號和4 號接種菌液處理的藍(lán)莓苗高生長顯著，3 號、5 號和6 號接種菌液處理的藍(lán)莓苗高差異不顯著。其中，接種1 號菌株處理的藍(lán)莓苗高生長最好，比CK 增長39.27%；其次是2 號和4 號菌株；苗高生長較差的是5 號菌株處理，增幅僅為15.25%。

表3 接種6 個菌株對藍(lán)莓苗高、地徑的影響

同樣，從表3 可以看出，人工接種內(nèi)生真菌同樣促進(jìn)藍(lán)莓苗木地徑的生長。其中，1 號、2 號和5號菌株處理的藍(lán)莓苗地徑生長量較大，與CK 相比差異顯著，3 號、4 號和6 號菌株與CK 相比差異不顯著，各菌株處理的藍(lán)莓苗地徑與CK 相比增長幅度為9.43%～21.43%。

2.3.2 生物量

由表4 得知，接種內(nèi)生真菌的藍(lán)莓植株根、莖、葉的生物量和總生物量均高于CK。其中，接種2號菌株的藍(lán)莓植株葉生物量、根生物量和總生物量均高于CK 且差異顯著，分別是CK 的1.56、1.36、1.33 倍，接種1 號菌株的藍(lán)莓植株莖生物量最重，是CK 的1.48 倍。對于總生物量而言，接種菌根處理的藍(lán)莓植株均顯著高于CK。就生物量分配來看，各處理的植株呈現(xiàn)地上部分生物量＞地下部分生物量；對于植株的不同部位，接種2 號、3 號、6 號菌株處理以及CK 的根生物量大于葉生物量、莖生物量；接種1 號、4 號菌株處理的莖生物量大于根生物量、葉生物量；而接種5 號菌株處理的則是葉生物量高于根生物量、莖生物量?？梢?，內(nèi)生真菌對藍(lán)莓植株的營養(yǎng)生長具有不同程度的促進(jìn)作用，尤以接種1 號和2 號菌株的促進(jìn)作用更明顯。

表4 接種6 個菌株對藍(lán)莓植株生物量及分配的影響

2.4 接種不同菌株對藍(lán)莓苗葉片光譜效應(yīng)的影響

2.4.1 葉片吸收率

由表5 得知，在470 nm 左右，各處理的藍(lán)莓葉片平均吸收率最大，隨著波長的增加，藍(lán)莓葉片吸收率呈下降趨勢，550 nm 左右各處理葉片出現(xiàn)較低的吸收率；隨后，隨著波長的增加，葉片吸收率呈上升趨勢，在波長為670 nm 時藍(lán)莓葉片出現(xiàn)較大的吸收率，但隨著波長的繼續(xù)增加，藍(lán)莓葉片的吸收率明顯下降，在780 nm 后平穩(wěn)下降。此外，接種內(nèi)生真菌的藍(lán)莓葉片吸收率在各波長段均大于CK，表明接種菌株促進(jìn)藍(lán)莓葉片對藍(lán)綠光和紅光的有利吸收。

表5 接種6 個菌株對藍(lán)莓葉片吸收率的影響

2.4.2 葉片反射率

從表6 可以看出，在測定波長范圍內(nèi)，接種不同菌株處理的藍(lán)莓葉片反射率變化一致，葉片反射率在550 nm 左右出現(xiàn)峰值，之后在670 nm 左右葉片反射率最低，隨著波長的增加，在780 nm 左右反射率迅速上升，形成“紅邊”現(xiàn)象，最后在近紅外區(qū)域達(dá)到相對平穩(wěn)，這與藍(lán)莓葉片吸收率變化趨勢不一致。另外，接種不同菌株處理的藍(lán)莓葉片反射率變化的峰值均小于CK。

表6 接種6 個菌株對藍(lán)莓葉片反射率的影響

2.4.3 葉片透射率

在測定波長范圍內(nèi)，接種不同菌株處理的藍(lán)莓葉片光譜在550 nm 左右有較高的透射率（表7），在670 nm 左右其透射率降到最低，在780 nm 左右透射率快速增加，后隨著波長的增加其透射率平穩(wěn)增加。另外，接種各菌株處理藍(lán)莓葉片透射率在470 nm 左右均大于CK，而在780 nm 和880 nm 左右其葉片透射率均小于CK，在其他波長范圍內(nèi)的透射率與CK 相比無明顯的變化規(guī)律。

表7 接種6 個菌株對藍(lán)莓葉片透射率的影響

2.5 接種不同菌株對藍(lán)莓苗快速光響應(yīng)主要參數(shù)的影響

通過對快速光響應(yīng)曲線進(jìn)行擬合，得到初始斜率（α）、最大電子傳遞速率（ETRm）、最小飽和光強(qiáng)（Ik）主要參數(shù)。由表8 得知，接種不同菌株對藍(lán)莓苗快速光響應(yīng)主要參數(shù)的影響差異顯著。其中，快速光響應(yīng)曲線的初始斜率表示光化學(xué)反應(yīng)的啟動速率，沒有接種菌株（CK）的藍(lán)莓苗初始斜率最高，而接種1 號菌株處理的藍(lán)莓苗初始斜率顯著低于CK，其他菌株處理的藍(lán)莓苗初始斜率與CK 相比差異不顯著，可見在光能利用之初藍(lán)莓苗對光能利用效率變化不明顯。

接種不同菌株藍(lán)莓苗葉片最大電子傳遞速率與CK 相比差異顯著。其中，接種4 號菌株的藍(lán)莓苗葉片最大電子傳遞速率最高，其次是1 號菌株。各接種菌株處理的最大電子傳遞速率比CK 增加了33.11%～71.94%（表8）。

表8 接種6 個菌株對藍(lán)莓快速光響應(yīng)主要參數(shù)的影響

接種不同菌株的藍(lán)莓苗最小飽和光強(qiáng)的變化與最大電子傳遞速率變化一致。接種不同菌株藍(lán)莓苗的最小飽和光強(qiáng)與CK 相比差異顯著，其中，接種4 號菌株的藍(lán)莓苗最小飽和光強(qiáng)最高，其次是1號菌株。各接種菌株處理的最小飽和光強(qiáng)比CK 增加了53.55%～110.59%（表8）。

綜合以上得出，接種4 號菌株的藍(lán)莓苗葉片電子傳遞速率快，對強(qiáng)光的耐受能力強(qiáng)于其他菌株處理。

2.6 接種不同菌株對藍(lán)莓葉片葉綠素含量和根系活力的影響

2.6.1 葉綠素含量

葉綠素是植物生長的主要光合色素，其含量可以在一定程度上反映植株進(jìn)行光合作用的潛力。由表9 得知，接種6 個不同內(nèi)生真菌處理的藍(lán)莓葉綠素a 含量與CK 相比差異不顯著；接種6 號菌株處理的葉綠素b 含量和葉綠素總含量與CK 相比差異顯著，接種其他菌株處理的葉綠素b 含量和葉綠素總含量與CK 相比差異不顯著。此外，接種6 號菌株處理的葉綠素總含量最高，為2.80 mg/g，是CK的1.5 倍；其次是2 號菌株處理，其葉綠素總含量為2.34 mg/g，是CK 的1.3 倍；接種5 號菌株處理的葉綠素總含量最低。相反，接種5 號菌株處理的葉綠素a/b 值最大，最小則為6 號菌株處理。

表9 接種6 個菌株對藍(lán)莓葉綠素含量的影響

2.6.2 根系活力

根系活力指標(biāo)能夠間接反映根系生長情況和吸收營養(yǎng)狀況水平。從圖1 可知，接種不同菌株處理對藍(lán)莓苗木根系活力的影響差異顯著，其根系活力變化范圍為103.08～236.13μg/g FW·h。其中，1號菌株處理的藍(lán)莓苗木根系活力最大，為236.13μg/g FW·h；其次是2 號菌株處理，根系活力為186.57μg/g FW·h；苗木根系活力最小的是3 號菌株處理，為136.54μg/g FW·h。各處理的根系活力與CK 相比增幅為32.46%～129.07%?？梢姡臃N菌株能顯著提高藍(lán)莓苗木的根系活力，從而促進(jìn)植株對水分和養(yǎng)分的吸收。

圖1 接種6 個菌株對藍(lán)莓苗根系活力的影響

2.7 接種不同菌株處理的綜合評價

由于各指標(biāo)的單位、性質(zhì)和數(shù)量的不同，采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行定量轉(zhuǎn)換。選用侵染率、苗高、地徑、生物量、最大電子傳遞速率（ETRm）、葉綠素總含量和根系活力作為隸屬函數(shù)綜合評價指標(biāo)。評價結(jié)果表明，接種不同菌株后對藍(lán)莓苗促生效果最為顯著的是1號和2號菌株，其次是4 號和6 號菌株，相對較差的是3 號和5 號菌株（表10）。由此可以初步篩選對藍(lán)莓苗促生效果較好的菌株為1 號、2 號、4 號和6 號。

表10 接種不同菌株對藍(lán)莓苗生長生理指標(biāo)的綜合評價

3 討論與結(jié)論

根系侵染率是菌株侵染根系效果的直接體現(xiàn)，而根系的侵染受土壤條件和真菌源數(shù)量等因素的影響[15-16]，因此，有報(bào)道人工種植的藍(lán)莓菌根形成率普遍較低[17]。肖軍等以發(fā)酵菌液的方式對藍(lán)莓進(jìn)行接種，接種后藍(lán)莓根系侵染率最高為63.3%[18]。本研究結(jié)果表明，在人工栽培藍(lán)莓中接種不同種類的內(nèi)生真菌，其侵染率最高可達(dá)57.5%，與前人的研究結(jié)果相似。另外，幾種菌株處理的侵染率不一致，可能的原因是不同菌株與藍(lán)莓根系的親和力以及受其他因素影響的適應(yīng)性不同所致。

菌根真菌對宿主植物水分、養(yǎng)分吸收最終體現(xiàn)在對植株生長的影響上。大量研究發(fā)現(xiàn)接種不同種類的菌株均對藍(lán)莓的生長有顯著的促進(jìn)作用[19-22]。本研究結(jié)果同樣表明，接種內(nèi)生真菌均顯著促進(jìn)了藍(lán)莓苗的生長，但各菌株對藍(lán)莓苗生長以及對植株的不同部位生長效果不同，可能原因是各個菌株發(fā)揮作用存在差異性。

植物的生理生化特征決定了其對光譜的吸收、反射和透射的變化，而植物的生理特性又相應(yīng)地反映了它的長勢情況。其中，色素是影響植物在可見光區(qū)域內(nèi)光譜特征的決定性因素。因此，可以通過檢測植株對光吸收、反射和透射的變化間接估測葉綠素以及葉片水分含量的變化[23-24]。結(jié)合前人的研究，通過對比葉片吸收、透射和反射光譜曲線，選擇470、550、670、780、880 nm 作為特征光譜波段，結(jié)果表明藍(lán)莓葉片對光的吸收、反射和透射率都會隨著波長的變化而有所不同?？傮w變化規(guī)律為各處理的葉片吸收率的峰值均大于CK，葉片反射率的峰值均小于CK，而葉片透射率與CK 相比無明顯的變化規(guī)律，說明接種內(nèi)生真菌能夠促進(jìn)藍(lán)莓苗葉片對光能的吸收，而減弱光對葉片的反射和透射。

根系是植物吸收外界養(yǎng)分和水分的主要器官，而根系活力綜合反映了根系養(yǎng)分吸收和物質(zhì)合成能力。有研究表明藍(lán)莓根系發(fā)育狀況及藍(lán)莓對菌根的依賴性與根系活力密切相關(guān)[25]。本研究中，接種6 種內(nèi)生真菌都顯著地提高了藍(lán)莓苗的根系活力，從而促進(jìn)了藍(lán)莓植株的生長。

為了更直觀地評價接種某種菌株對藍(lán)莓苗侵染、生長生理效應(yīng)的影響，選用侵染率、苗高、地徑、生物量、最大電子傳遞速率、葉綠素總含量和根系活力作為隸屬函數(shù)綜合評價指標(biāo)，評價結(jié)果表明，接種不同內(nèi)生真菌后對藍(lán)莓苗促生效果最為顯著的是1 號和2 號菌株，其次是4 號和6 號菌株，相對較差的是3 號和5 號菌株，由此可以初步篩選對藍(lán)莓苗促生效果較好的菌株為1 號、2 號、4 號和6 號。但對于自然環(huán)境中的栽培藍(lán)莓而言，某種菌根真菌并不是單獨(dú)孤立存在的，而是以多樣性的方式存在。因此為了更好地模擬自然界中真菌-植物根系的共生狀態(tài)，研究2 種或2 種以上的菌株共同接種對藍(lán)莓苗生長發(fā)育的影響是今后研究的重點(diǎn)，這樣能更好地提高植株的侵染率以及為生產(chǎn)實(shí)踐服務(wù)。