胡淑紅

綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江杭州 310000

0 引言

葉酸，是一種水溶性B族維生素，俗稱(chēng)維生素B9，是合成核酸所必須的元素，是細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)所必須的物質(zhì)，在蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要作用，尤其對(duì)紅細(xì)胞的形成具有促進(jìn)作用，缺乏時(shí)可導(dǎo)致紅細(xì)胞中血紅蛋白生成減少、細(xì)胞成熟受阻，導(dǎo)致巨幼紅細(xì)胞性貧血，因此對(duì)孕婦和嬰幼兒尤為重要。

我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)嬰幼兒配方乳粉（簡(jiǎn)稱(chēng)“嬰配粉”）中強(qiáng)化維生素的含量有嚴(yán)格要求，對(duì)于嬰幼兒葉酸含量一般要求在2.5~12.0 μg/100 kJ之間，較大嬰兒和幼兒最低含量為1 μg/100 kJ[1，2]。葉酸能夠促進(jìn)嬰幼兒身體器官的發(fā)育，增加?jì)雰旱拿庖吡?，因此育齡期女性合理補(bǔ)充葉酸，是促進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育的重要措施[3]。研究表明，葉酸攝入不足或代謝通路受阻會(huì)增加腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)[4]，低水平的葉酸也可能是阿爾茲海默癥的危險(xiǎn)因素[5]，因此維持較好地葉酸水平對(duì)降低高血壓、預(yù)防和控制心腦血管疾病具有重要意義[6]。

微生物法可以測(cè)定成分復(fù)雜樣品中的葉酸含量，具有批量測(cè)定成本較低的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果較液相法更準(zhǔn)確，靈敏度更高，但操作復(fù)雜，試驗(yàn)周期長(zhǎng)。

本文優(yōu)化了《GB 5009.211-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測(cè)定》方法，改進(jìn)微生物法檢測(cè)葉酸操作繁瑣和試驗(yàn)周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，以嬰配粉為樣本，優(yōu)化接種液的制備方法和葉酸培養(yǎng)液的培養(yǎng)時(shí)間，并對(duì)該方法的精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行了研究。

1 試驗(yàn)方法

1.1 儀器設(shè)備與試劑

1.1.1 儀器設(shè)備

UV 1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津（中國(guó)）有限公司；KQ 5200超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司；VORTEX-6渦旋振蕩器，Qilin Beier；AUW220DASSY分析天平，島津（中國(guó)）有限公司；GI80TW滅菌鍋，至微（廈門(mén)）儀器有限公司；HFsafe-1500LC生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.1.2 試劑

本方法所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二級(jí)水。

（1）乙醇溶液（20%，體積分?jǐn)?shù)）：量取200 mL無(wú)水乙醇與800 mL水混勻。

（2）氫氧化鈉乙醇溶液（0.01 mol/L）：稱(chēng)取0.4 g氫氧化鈉，用乙醇溶液溶解并稀釋至1 L，混勻。

（3）氫氧化鈉溶液（1 mol/L）：稱(chēng)取40 g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1 L，混勻。

（4）鹽酸溶液（1 mol/L）：量取83.3 mL鹽酸，用水稀釋至1 L，混勻。

（5）乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（BD）：按培養(yǎng)基使用說(shuō)明書(shū)配制。

（6）乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（BD）：按培養(yǎng)基使用說(shuō)明書(shū)配制。

（7）葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基（BD）：按培養(yǎng)基使用說(shuō)明書(shū)配制。

（8）葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（C19H19N7O6）：純度≥99%。

（9）菌種為鼠李糖乳桿菌（ATCC 7469）。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（20 μg/mL）：精確稱(chēng)取20.0 mg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，用氫氧化鈉乙醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)256 nm條件下，進(jìn)行濃度標(biāo)定并計(jì)算得最終濃度。

（2）葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（0.200 μg/mL）：準(zhǔn)確吸取1.00 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于100 mL棕色容量瓶中，用氫氧化鈉乙醇溶液稀釋并定容至刻度，混勻。

（3）葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.200 ng/mL）：準(zhǔn)確吸取1.00 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液置于1 000 mL容量瓶中，用水稀釋定容至刻度，混勻。

1.1.4 菌株活化

將接種液與甘油按1:1（V:V）比例混合均勻，分裝于小離心管，-80 ℃凍存[7]，作為儲(chǔ)備菌株。試驗(yàn)前將儲(chǔ)備菌株接種至瓊脂培養(yǎng)基中，在（37±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（18±2）h以活化菌株，一般活化2~3 代，不超過(guò)5 代，用于接種液的制備。

1.1.5 樣品來(lái)源

市售嬰配粉：某品牌金裝嬰兒配方奶粉（1段），較大嬰兒配方奶粉（2段）和幼兒配方奶粉（3段），每種各2 罐，分別編號(hào)為Y1-1，Y1-2，Y2-1，Y2-1，Y3-1，Y3-2。

1.2 試驗(yàn)步驟

1.2.1 樣品待測(cè)液制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取嬰配粉0.4 g，精確至0.001 g，轉(zhuǎn)入100 mL錐形瓶中，加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液，具塞，超聲振蕩2~4 h至嬰配粉完全溶解分散（注意超聲清洗機(jī)中水的溫度，必要時(shí)換水），轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。吸取5 mL至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。

1.2.2 測(cè)定系列管制備

所用試管使用前刷干凈，瀝干后放入鹽酸浸泡液中浸泡2 h，經(jīng)（170±2）℃烘干3 h后使用。（1）標(biāo)準(zhǔn)系列管

取試管分別加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液0.00 mL、0.00 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL，補(bǔ)水至5 mL，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸含量為0.00 ng、0.00ng、0.05 ng、0.10 ng、0.20 ng、0.30 ng、0.40 ng、0.50 ng、0.60 ng、0.80 ng、1.00 ng，再加入5.0 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基，混勻。制備三套標(biāo)準(zhǔn)系列管。

（2）樣品系列管

取3 支試管，分別加入0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL嬰配粉稀釋液，補(bǔ)水至5 mL，加入5 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)基，混勻。

1.2.3 滅菌

將所有測(cè)定系列管具塞，于121 ℃高壓滅菌5 min。

1.2.4 接種液制備

取1.1.4的活化菌株，接種于乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，（37±1）℃恒溫培養(yǎng)6~10 h，后將菌懸液分裝至無(wú)菌離心管（1.5 mL）中，3 000 r/min離心10 min，傾倒上清液，重復(fù)清洗菌體3 次后，加入1 mL滅菌生理鹽水復(fù)懸菌體，吸取1 mL菌懸液加入10 mL滅菌生理鹽水中混勻，即為接種菌懸液。

1.2.5 接種

將滅菌后的樣品管和標(biāo)準(zhǔn)管快速冷卻至室溫后，在無(wú)菌操作條件下，接種50 μL于測(cè)定系列管中，具塞，混勻。標(biāo)準(zhǔn)管中的空白管分別作接種空白管和接種空白管。

1.2.6 培養(yǎng)

接種后系列管于（37±1）℃恒溫培養(yǎng)（20±2）h，直至獲得最大渾濁度，即再培養(yǎng)2 h吸光度值無(wú)明顯變化。

1.2.7 測(cè)定

將培養(yǎng)好的標(biāo)準(zhǔn)系列管、樣品管用渦旋混勻器混勻，于550 nm處，以未接種空白管為測(cè)定空白管，依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣管。以葉酸含量為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用樣品吸光度值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出數(shù)值，通過(guò)公式計(jì)算得出葉酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性考察

按1.2.2.1制備標(biāo)準(zhǔn)曲線系列管，以葉酸含量為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表1和圖1所示。

表1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

從圖1看出，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距值較小，R2=0.994，標(biāo)曲的線性良好，而且是隨著葉酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度增大，吸光度值也增大。由此可得該試驗(yàn)方法的葉酸吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)液濃度成正比[8]。

圖1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 方法精密度試驗(yàn)

2.2.1 日內(nèi)精密度

對(duì)1 份試樣檢測(cè)試驗(yàn)，做10 個(gè)平行試驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如表2所示。

2.2.2 日間精密度

對(duì)1 份試樣試驗(yàn)，每天做4 個(gè)平行試驗(yàn)，做3 天試驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果如表3所示。

由表2和表3可得，RSD值均在3%以下，本試驗(yàn)方法的日內(nèi)精密度和日間精密度均為良好。

表2 方法日內(nèi)精密度測(cè)試數(shù)據(jù)

表3 方法日間精密度測(cè)試數(shù)據(jù)

2.3 方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)

同一試樣作為本底，本底含量為80.1 μg/100 g，分別進(jìn)行3組不同濃度的加標(biāo)試驗(yàn)，每組做3 個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率，如表4所示。

由表4可得，通過(guò)不同的加標(biāo)量所得的回收率均在80%~105%的范圍內(nèi)，回收率的平均值均在90%以上，而且RSD值均在3%以下，試驗(yàn)值均比較穩(wěn)定。

由表4的準(zhǔn)確度可得，葉酸優(yōu)化方法比較穩(wěn)定，試驗(yàn)誤差小，準(zhǔn)確率高。

表4 葉酸試樣加標(biāo)測(cè)試數(shù)據(jù)

2.4 方法穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別對(duì)某品牌嬰兒配方奶粉，較大嬰兒配方奶粉及幼兒配方奶粉葉酸的含量測(cè)定，結(jié)果如表5所示。

表5 不同階段嬰幼兒配方奶粉葉酸的含量

由表5可得，不同階段嬰幼兒配方奶粉葉酸測(cè)定含量RSD均在3%以下，故方法穩(wěn)定性較為良好。

3 小結(jié)

本研究是在《GB 5009.211—2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測(cè)定》方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化接種液制備的操作步驟，縮短培養(yǎng)液的培養(yǎng)時(shí)間而建立的，該法標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.9943，回收率＞90%，精密度RSD<3%，準(zhǔn)確度RSD<3%，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD<3%，該檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性呈現(xiàn)度好，精密度高，準(zhǔn)確度高，方法穩(wěn)定性良好，所需設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，較大程度地縮短了試驗(yàn)周期，提高了檢測(cè)效率，為優(yōu)化微生物法檢測(cè)葉酸提供依據(jù)。