解園星 王文鋒 田紅燕

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，多發(fā)于老年人，已成為引起老年人死亡的重要原因之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，DCM患者脂代謝異常、葡萄糖自身氧化及線粒體氧化等過程均可促進(jìn)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)聚集及氧化應(yīng)激反應(yīng)激活，導(dǎo)致DCM患者心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及過度凋亡，甚至心力衰竭的發(fā)生[2]。阿昔莫司為煙酸衍生物，是臨床常用的調(diào)脂、降脂藥[3]，可用于冠心病[4]、糖尿病伴血脂異常的治療[5]。但阿昔莫司是否能應(yīng)用DCM治療，其對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷是否有保護(hù)作用，筆者還未見報道。本研究用高糖條件，體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞模擬DCM模型，從氧化應(yīng)激方面探討其對心肌細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制，以期為阿昔莫司在DCM領(lǐng)域的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑與儀器 大鼠心肌H9C2細(xì)胞(購自上海明舟生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：MZ-2622)。DMEM培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司，貨號：90113)；阿昔莫司(上海玉博生物科技有限公司，貨號：CP-100750)；MTT試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：M1020)；活性氧簇(ROS)免疫熒光探針試劑盒(美國abcam公司，貨號：ab62623)；超氧化物歧化酶(SOD)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、活性氧簇(ROS)、抗氧化酶超氧化物歧化酶2(SOD2)、脂質(zhì)過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)、心肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)-細(xì)胞膜糖蛋白(CD36)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)一抗(美國abcam公司，貨號：ab83108、ab91606、ab189925、ab68155、ab272718、ab256470、ab32572、ab252922、ab188317)；熒光顯微鏡(型號：BX63，日本奧林巴斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理:取大鼠心肌H9C2細(xì)胞株，常規(guī)復(fù)蘇后，用DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素)，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期細(xì)胞，按1×105個/ml密度接種于6孔板中，并進(jìn)行如下處理：①對照組、低糖組、等滲組、高糖組，對照組采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，低糖組及高糖組分別加入終濃度為5.6 mmol/L、30.0 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)，等滲組在低糖組基礎(chǔ)上加入24.4 mmol/L甘露醇培養(yǎng)，各組均培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞，采用MMT法檢測細(xì)胞存活率，Western blot法檢測SOD、LPL蛋白表達(dá)。②在高糖(30 mmol/L)條件下，用不同濃度阿昔莫司(0、5、10、25、50 μg/L)干預(yù)培養(yǎng)24 h，檢測細(xì)胞存活率及SOD、LPL蛋白表達(dá)。③敲低SOD，并分為空白組、高糖組、阿昔莫司組、Si-SOD組、Si-NC組、阿昔莫司+Si-SOD組；空白組不做處理，正常培養(yǎng)；高糖組加入終濃度為30.0 mmol/L葡萄糖進(jìn)行培養(yǎng)；阿昔莫司組在高糖組基礎(chǔ)上加入終濃度為25 μg/L阿昔莫司溶液干預(yù)培養(yǎng)；Si-SOD及Si-NC組在轉(zhuǎn)染SOD低表達(dá)序列腺病毒載體及其空載體腺病毒6 h后，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)；阿昔莫司+Si-SOD組在阿昔莫司組基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染Si-SOD；各組均培養(yǎng)24 h后，檢測細(xì)胞活性，細(xì)胞氧化應(yīng)激及脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率:取處理后的各組細(xì)胞，每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液于培養(yǎng)箱中放置4 h后，棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μl搖床振蕩15 min后，在490 nm波長下，用酶標(biāo)儀讀取各組OD值，根據(jù)公式，細(xì)胞存活率=(對照組OD值-給藥組OD值)/對照組OD值×100%，計算出各組細(xì)胞存活率。

1.2.3 Western blot法檢測細(xì)胞SOD、LPL、SOD2、PPARα、GPx、CAT、CD36、GLUT4蛋白表達(dá):收集各組細(xì)胞，裂解、抽提蛋白，BCA法測蛋白濃度，取50 μg蛋白樣品行電泳及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入一抗(SOD、LPL、SOD2、PPARα、GPx、CAT、CD36、GLUT4抗體(1∶800)，內(nèi)參GAPDH(1∶1 000)，4℃孵育過夜，加入二抗(1∶1 000)室溫孵育1h，ELC顯影曝光，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照，以Image J分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞損傷狀況:取上述1.2.1中③處理下的各組細(xì)胞，棄去上清液，磷酸緩沖液洗滌后，加入胰蛋白酶(0.125%，2 ml)消化5 min，2 000 r/min離心15 min，取下層細(xì)胞沉淀物，用戊二醛4℃固定4 h后，在電鏡下觀察細(xì)胞損傷狀況。

1.2.5 油紅O染色觀察細(xì)胞脂質(zhì)堆積狀況:取上述1.2.1中③處理下的各組細(xì)胞，棄去上清液，磷酸緩沖液洗滌后，用60%異丙醇固定后，加入油紅染液孵育30 min，蘇木精復(fù)染后，棄去染色液，封片后在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，拍照，采用異丙醇萃取法提取油紅O，酶標(biāo)儀檢測492 nm除OD值。

1.2.6 免疫熒光檢測細(xì)胞ROS蓄積狀況:取上述1.2.1中③處理下的各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定、曲拉通透化后，加入5 μmol/L離子熒光探針液，37℃孵育30 min，用Bio-Rad Radiance 2100 MP多光子顯微鏡和ImagePro分析軟件對細(xì)胞內(nèi)ROS熒光分布進(jìn)行分析。每組隨機(jī)選取5個視野，以單位面積內(nèi)熒光強(qiáng)度代表ROS蓄積水平。

1.2.7 TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡水平:取上述1.2.1中③處理下的各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定后，按TUNEL染色試劑盒說明書方法進(jìn)行染色、封片后置于顯微鏡下觀察拍照，用Image-pro plus軟件系統(tǒng)檢測棕黃色染色的凋亡細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葡萄糖對細(xì)胞存活率及SOD、LPL表達(dá)的影響 MTT顯示，糖濃度越高細(xì)胞存活率越低(P<0.05)。Western blot顯示，糖濃度越高SOD表達(dá)越低(P<0.05)，LPL表達(dá)越高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 不同濃度高糖處理下SOD、LPL蛋白表達(dá)免疫印跡圖;A 對照組；B 低糖組；C 等滲組；D 高糖組

表1 不同濃度葡萄糖處理下細(xì)胞SOD、LPL蛋白表達(dá)比較

2.2 不同濃度阿昔莫司對細(xì)胞存活率及SOD、LPL蛋白表達(dá)的影響 高糖條件下，隨著阿昔莫司濃度(0、5、10、25、50 μg/L)升高，細(xì)胞存活率逐漸升高(P<0.05)，并在25～50 μg/L達(dá)到最高。SOD蛋白表達(dá)逐漸升高(P<0.05)，LPL蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，且在25～50 μg/L達(dá)到最高及最低。見圖2，表2。

圖2 不同濃度阿昔莫司處理下細(xì)胞存活率(MTT檢測)及SOD、LPL蛋白表達(dá)免疫印跡圖

表2 不同濃度阿昔莫司處理條件下細(xì)胞SOD、LPL蛋白表達(dá)比較

2.3 阿昔莫司處理及敲低SOD對細(xì)胞存活率與凋亡率的影響 與空白組比較，高糖組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)。與高糖組比較，阿昔莫司組存活率升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)；Si-SOD組細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低(P<0.05)，凋亡率進(jìn)一步升高(P<0.05)。阿昔莫司+Si-SOD組指標(biāo)變化與阿昔莫司組相反(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 阿昔莫司處理及敲低SOD后的細(xì)胞(TUNEL染色×400)

表3 阿昔莫司處理及敲低SOD后細(xì)胞凋亡率比較

2.4 阿昔莫司處理及敲低SOD對細(xì)胞損傷及脂質(zhì)堆積的影響 電鏡下，空白組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，僅有少量脂滴形成；經(jīng)油紅O染色后可見胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色。與空白組比較，電鏡下高糖組細(xì)胞腫脹，胞膜及胞核固縮，細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹及脂滴形成較多，染色后發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)脂質(zhì)紅染顏色加深，胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加，脂質(zhì)堆積嚴(yán)重(P<0.05)。與高糖組比較，阿昔莫司組細(xì)胞損傷、脂滴形成，脂質(zhì)紅染減輕，脂質(zhì)堆積減緩(P<0.05)；Si-SOD組細(xì)胞損傷及胞內(nèi)脂質(zhì)堆積進(jìn)一步加重(P<0.05)。阿昔莫司+Si-SOD組上述指標(biāo)變化與阿昔莫司組相反，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4，表4。

空白組高糖組阿昔莫司組Si-SOD組阿昔莫司+Si-SOD組Si-NC組

表4 阿昔莫司處理或敲低SOD后細(xì)胞脂質(zhì)含量比較

2.5 阿昔莫司處理及敲低SOD對細(xì)胞ROS蓄積的影響 免疫熒光染色可見空白組細(xì)胞胞質(zhì)中有少量顯綠色熒光的ROS蓄積。與空白組比較，高糖組細(xì)胞ROS蓄積增強(qiáng)(P<0.05)。與高糖組比較，阿昔莫司組細(xì)胞ROS蓄積減弱(P<0.05)；Si-SOD組細(xì)胞ROS蓄積進(jìn)一步增強(qiáng)(P<0.05)。阿昔莫司+Si-SOD組上述指標(biāo)變化與阿昔莫司組相反(P<0.05)。見表5，圖5。

表5 細(xì)胞ROS水平比較

空白組高糖組阿昔莫司組Si-SOD組阿昔莫司+Si-SOD組Si-NC組

2.6 阿昔莫司處理及敲低SOD對細(xì)胞LPL、PPARα、CD36、GLUT4蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，高糖組細(xì)胞LPL、PPARα、CD36蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，GLUT4蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與高糖組比較，阿昔莫司組細(xì)胞LPL、PPARα、CD36蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，GLUT4蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；Si-SOD組細(xì)胞LPL、PPARα、CD36蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)，GLUT4蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)。阿昔莫司+Si-SOD組上述指標(biāo)變化與阿昔莫司組相反(P<0.05)。見表6，圖7。

表6 細(xì)胞LPL、PPARα、CD36、GLUT4蛋白表達(dá)比較

圖7 細(xì)胞LPL、PPARα、CD36、GLUT4蛋白表達(dá)免疫印跡圖；A為空白組；B為高糖組；C為阿昔莫司組；D為Si-SOD組；E為阿昔莫司+Si-SOD組；F為Si-NC組

2.7 阿昔莫司處理及敲低SOD對細(xì)胞SOD、SOD2、GPx、CAT蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，高糖組細(xì)胞SOD、SOD2、GPx、CAT蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與高糖組比較，阿昔莫司組細(xì)胞SOD、SOD2、GPx、CAT蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；Si-SOD組細(xì)胞SOD、SOD2、GPx、CAT表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)。阿昔莫司+Si-SOD組上述指標(biāo)變化與阿昔莫司組相反(P<0.05)。見圖8，表7。

圖8 細(xì)胞SOD、SOD2、GPx、CAT蛋白表達(dá)免疫印跡圖；A為空白組；B為高糖組；C為阿昔莫司組；D為Si-SOD組；E為阿昔莫司+Si-SOD組；F為Si-NC組

表7 細(xì)胞SOD、SOD2、GPx、CAT蛋白表達(dá)比較

3 討論

DCM已成為困擾老年人健康的重要疾病之一，隨著社會老齡化的推進(jìn)、糖尿病發(fā)生率的升高，DCM發(fā)病率也逐漸升高[6]。目前國內(nèi)外仍無特殊有效的方法治療糖尿病并發(fā)癥，降低人們罹患DCM的風(fēng)險[7]。

DCM的病理機(jī)制也極為復(fù)雜，研究證實，糖尿病誘發(fā)的心肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂是糖尿病及DCM發(fā)生發(fā)展的始發(fā)因素，且調(diào)控心肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝，是預(yù)防及治療DCM的關(guān)鍵方法[8]。Chiu等[9]體內(nèi)外試驗研究發(fā)現(xiàn)，高糖條件均可引起心肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常。LPL是脂蛋白降解及脂質(zhì)代謝過程中的關(guān)鍵限速酶，能夠水解細(xì)胞外的三酰甘油釋放出游離脂肪酸，使胞內(nèi)游離脂肪酸增加[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著糖濃度增加，細(xì)胞LPL蛋白表達(dá)也顯著升高。阿昔莫司為臨床常用的降脂、調(diào)脂藥。崔靜華[10]發(fā)現(xiàn)阿昔莫司在降血脂的同時，還可顯著降低血糖水平；熊守慶等[4]發(fā)現(xiàn)阿昔莫司可用于老年冠心病。本研究隨著阿昔莫司干預(yù)水平的升高，高糖培養(yǎng)條件下的心肌細(xì)胞活性水平升高，而LPL蛋白降低，提示阿昔莫司可有效降低高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞脂質(zhì)分泌，緩解心肌細(xì)胞損傷。

另外，高糖環(huán)境，也可通過脂質(zhì)代謝、葡萄糖自身氧化、線粒體氧化磷酸化，來釋放大量ROS促進(jìn)氧化應(yīng)激激活、加速心肌細(xì)胞凋亡和DNA損傷[11]。且持續(xù)的高血糖刺激心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是DCM重要發(fā)病機(jī)制之一[12]。SOD是重要的抗氧化指標(biāo)，其活性降低可升高ROS水平，引起心肌細(xì)胞損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著糖濃度及LPL表達(dá)的升高，心肌細(xì)胞活性下降，細(xì)胞脂質(zhì)含量升高，SOD表達(dá)水平也明顯降低，而高糖條件下敲低SOD后，心肌細(xì)胞腫脹、損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)含量進(jìn)一步加重，ROS水平蓄積、LPS水平進(jìn)一步升高，心肌細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加。本研究結(jié)果顯示，隨著阿昔莫司干預(yù)濃度的升高，高糖誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、脂質(zhì)含量、凋亡顯著降低，ROS水平蓄積減少，SOD表達(dá)水平也明顯升高，且Si-SOD可逆轉(zhuǎn)阿昔莫司的上述作用，表明阿昔莫司對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有明顯的緩解作用，預(yù)示阿昔莫司也可能為治療DCM的潛在藥物。

PPARα為配體脂肪酸激活的轉(zhuǎn)錄因子，其激活后，可與視黃酸X受體結(jié)合形成復(fù)合體，來作用于脂肪酸代謝相關(guān)基因的啟動子區(qū)，從而調(diào)控脂肪酸代謝相關(guān)基因如脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36及線粒體脂肪酸氧化相關(guān)酶GLUT4表達(dá)，來促進(jìn)心肌細(xì)胞對脂肪酸的攝取、抑制葡萄糖的攝取和利用，導(dǎo)致脂質(zhì)蓄積，心肌細(xì)胞能量代謝異常，而誘發(fā)DCM產(chǎn)生[14]。Zong等[15,16]在DCM模型心肌組織及高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中均檢測到PPARα激活。另外，過量的脂肪酸攝取，會超過心肌細(xì)胞線粒體的氧化能力，促進(jìn)ROS的蓄積及釋放，此時若體內(nèi)抗氧化酶水平不足，體內(nèi)氧化/抗氧化作用失衡，會加速細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]，DCM患者常伴血脂、血糖升高，心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷加重。SOD、GPx、CAT為主要的抗氧化酶，當(dāng)線粒體產(chǎn)生ROS時，線粒體中的抗氧化酶SOD2可將O2-催化產(chǎn)生成過氧化氫(H2O2)，而GPx、CAT可將H2O2依次降解成為水(H2O)，而發(fā)揮抗氧化作用[18,19]。廖榮華等[20]在高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，檢測到SOD、GPx、CAT水平的異常降低。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)下，心肌細(xì)胞脂質(zhì)異常相關(guān)蛋白PPARα、CD36表達(dá)異常升高，GLUT4表達(dá)降低，ROS升高，而抗氧化SOD、GPx、CAT水平異常降低，提示高糖條件下脂質(zhì)異常代謝，引起的ROS水平升高，抗氧化能力降低，可能是導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及凋亡的原因。阿昔莫司干預(yù)組顯示出PPARα表達(dá)、脂質(zhì)堆積及ROS蓄積的降低，和抗氧化SOD、GPx、CAT水平的升高，而Si-SOD可逆轉(zhuǎn)阿昔莫司的上述作用，提示阿昔莫司降低高糖條件下心肌細(xì)胞凋亡及脂質(zhì)堆積的可能作用為升高抗氧化酶表達(dá)來實現(xiàn)的。

綜上所述，阿昔莫司能抑制PPARα活化，升高SOD、GPx、CAT抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)，緩解脂質(zhì)堆積及氧化應(yīng)激損傷，對高糖誘導(dǎo)條件下心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。這可能為阿昔莫司在DCM領(lǐng)域的治療提供一定參考。