霍霞飛，張德權(quán)，蘇媛媛，古明輝，陳 麗，李少博，王 衛(wèi)，鄭曉春,*

（1.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)品質(zhì)量安全 收貯運管控重點實驗室，北京 100193；3.成都大學(xué) 肉類加工四川省重點實驗室，四川 成都 610106）

我國是肉類生產(chǎn)與消費大國，據(jù)國家統(tǒng)計局公布數(shù)據(jù)顯示，2021年全國肉類總產(chǎn)量8 887 萬t。冷鮮肉富含蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)且水分含量高，導(dǎo)致其在流通、貯藏過程中極易受到微生物侵染，發(fā)生腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生食品安全和食品資源浪費等問題。新鮮度是肉制品變質(zhì)過程中外在感官、內(nèi)部理化特性和微生物生長情況的綜合衡量標(biāo)準。冷鮮肉在微生物和自身酶的作用下會發(fā)生腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生與新鮮度相關(guān)的特征性釋放物。已有研究表明，在細菌和酶的作用下，肉類中的少量蛋白質(zhì)逐漸分解成肽和氨基酸，最后降解成氨、胺等小分子化合物，這些含氮的小分子化合物具有高度揮發(fā)性，是肉類腐敗氣味的主要來源。三甲胺和二甲胺是肉類及水產(chǎn)品中常見的揮發(fā)性胺，常被視為表征肉類和海鮮腐敗的重要指標(biāo)。冉云等利用三甲胺表征縊蟶貯藏期間新鮮度，結(jié)果表明，三甲胺的總量隨貯藏時間延長而不斷增加。鄭剛等利用頂空氣相色譜法測定雞肉、豬肉、火腿中三甲胺含量，結(jié)果表明，三甲胺含量隨著貯藏時間的延長而呈現(xiàn)上升趨勢。胡洋洋等以二甲胺為靶標(biāo)物質(zhì)，分析不同溫度下鯽魚的新鮮度，結(jié)果表明，二甲胺的總量隨貯藏時間延長而不斷減少。池葉艷等利用氣相色譜法對甌江淡水魚中的二甲胺含量進行分析，結(jié)果表明，二甲胺含量隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢。上述研究結(jié)果表明，水產(chǎn)品中三甲胺和二甲胺作為新鮮度指標(biāo)的研究已有初步結(jié)論，而冷鮮肉中三甲胺、二甲胺隨貯藏時間的變化規(guī)律鮮有報道，二者之間的關(guān)系尚不明確。因此，本研究以（0.0±0.5） ℃冷鮮羊肉為研究對象，探究三甲胺、二甲胺在羊肉貯藏過程中隨新鮮度指標(biāo)變化的變化規(guī)律，確證其能否表征冷鮮羊肉新鮮度，旨在為冷鮮羊肉新鮮度的快速檢測技術(shù)研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6～8 月齡小尾寒羊背最長肌購于北京二商穆香源清真肉類食品有限公司。

2-硫代巴比妥酸 上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸 上海麥克林生化科技有限公司；平板計數(shù) 瓊脂 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；乙酸銨、冰醋酸、硫酸銅、二硫化碳 美國Sigma公司；丁基羥基茴香醚、鹽酸、氫氧化鈉、氧化鎂、丙二醇、苯、氨水 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Testo 205便攜式pH計 德國德圖公司；SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司； CM-600D色差計 柯尼卡-美能達辦公系統(tǒng)（中國）有限公司；JYH-66恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；垂直單向流潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SQ810C高壓蒸汽滅菌器 上海雅馬拓科技貿(mào)易有限公司；Kjeltec 2300全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss集團有限公司；Ultra Turax Disperser S25勻漿器 德國IKA公司；TSQ 9000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

選取胴體質(zhì)量、飼養(yǎng)條件相近、性別相同、健康無病的小尾寒羊6 只，宰后胴體預(yù)冷24 h后，取雙側(cè)背最長肌，均勻分割，約200 g/塊。每條背最長肌分割為6 塊，共計制得72 個樣品，每個樣品分裝至無菌袋中，置于低溫保溫箱中2 h內(nèi)運回實驗室；使用PP5聚丙烯塑料盒進行空氣密封包裝（包裝盒規(guī)格23 cm×13 cm×4 cm，包裝膜厚度100 μm，透氧性＜2 cm/（m·d），透濕性＜5 g/（m·d），氣體空間約400 mL）后，于（0.0±0.5） ℃條件下貯藏0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d；處理當(dāng)天開始，在規(guī)定時間點每次隨機取出6 個樣品進行實驗，測定其色澤、菌落總數(shù)、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量等新鮮度指標(biāo)及三甲胺、二甲胺含量的變化情況。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 色澤測定

參考Li Xin等的方法，用黑白參考校正后的色差計對肉色指標(biāo)進行測定，在每個樣品表面隨機選擇4 個位點進行測定，結(jié)果取平均值。

1.3.2.2 pH值測定

參考Szerman等的方法，將pH計用pH 4.01和pH 7.00 2 種校正液校正后，再將校正后的pH計探頭插入羊肉中，深度約2 cm，選取3 個不同位置進行測定，結(jié)果取平均值。

1.3.2.3 硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值測定

參考GB 5009.181—2016《食品安全國家標(biāo)準 食品中丙二醛的測定》中第二法進行測定，結(jié)果用每千克肉中丙二醛的毫克數(shù)表示。

1.3.2.4 菌落總數(shù)測定參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》中規(guī)定的方法進行測定。

1.3.2.5 TVB-N含量測定

參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中規(guī)定的自動凱氏定氮法進行測定。

1.3.2.6 包裝及肉中二甲胺含量測定

包裝中二甲胺含量的測定參考張勇等的方法，以0.01 mol/L鹽酸異丙醇溶液為吸收液，20 mL頂空瓶作吸收瓶，向頂空瓶中加入10 mL吸收液，用注射器抽取包裝有肉樣的密封包裝盒中空氣20 mL，緩慢注入吸收瓶中并渦旋混勻；肉中二甲胺含量的測定參考戚勃等的方法，稱取攪碎混勻的肉樣5 g，置于100 mL離心管中，加入50 g/L三氯乙酸溶液45 mL，勻漿約20 s，5 000 r/min離心10 min，過濾于100 mL容量瓶中；沉淀再重復(fù)處理1 次，合并2 次濾液，用50 g/L三氯乙酸溶液定容。

取樣品溶液5 mL，再加入1 mL 120 g/L NaOH、1 mL銅銨試劑和10 mL CS苯溶液，混勻；50 ℃水浴3 min，立即劇烈振搖150 次，再加入1 mL體積分數(shù)35%的醋酸溶液，立即振搖120 次，靜置30 min；吸取上層顯色液，利用酶標(biāo)儀在434 nm波長處測定吸光度，包裝中二甲胺含量用吸收液作空白實驗，肉中二甲胺含量用三氯乙酸溶液作空白實驗。

包裝中二甲胺含量按式（1）計算。

式中：為包裝中二甲胺含量/（μg/mL）；為樣品溶液中二甲胺含量/μg；為吸收液中二甲胺含量/μg；為吸收液體積/mL。

肉中二甲胺含量按式（2）計算。

式中：為肉中二甲胺含量/（μg/g）；為樣品溶液中二甲胺質(zhì)量濃度/（μg/mL）；為樣品溶液定容體積/mL；為取樣量/g。

1.3.2.7 包裝及肉中三甲胺含量測定

包裝中三甲胺含量的測定參考GB 5009.179—2016《食品安全國家標(biāo)準 食品中三甲胺的測定》、 GB/T 14676—93《空氣質(zhì)量 三甲胺的測定 氣相色譜法》并稍作修改：以0.02 mol/L鹽酸作為吸收液，向20 mL頂空瓶中加入5 mL吸收液，用注射器抽取空氣包裝盒中的空氣20 mL，緩慢注入吸收瓶中并渦旋，制得提取液。肉中三甲胺含量的測定參照GB 5009.179—2016中的頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行測定，結(jié)果以每克肉中三甲胺的微克數(shù)表示：稱取均質(zhì)后的樣品10 g置于50 mL離心管中，加入20 mL 5 g/100 mL三氯乙酸溶液，均質(zhì)1 min后以4 000 r/min離心5 min，過濾后定容至50 mL， 制得提取液。

準確吸取提取液2.0 mL于20 mL頂空瓶中，加入5.0 mL 1 g/mL氫氧化鈉溶液，上氣相色譜-質(zhì)譜儀進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)使用Excel 2013軟件整理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準差表示，并進行數(shù)據(jù)分析與作圖，采用Origin 2019軟件對三甲胺、二甲胺含量變化作圖；采用IBM SPSS 21.0軟件中Duncan’s多重檢驗進行顯著性分析；采用IBM SPSS 21.0軟件中的Pearson相關(guān)性分析冷鮮羊肉新鮮度指標(biāo)與三甲胺、二甲胺含量的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮羊肉貯藏期間新鮮度變化

2.1.1 冷鮮羊肉貯藏期間色澤、pH值變化

羊肉pH值變化與新鮮度相關(guān)，是判斷羊肉新鮮度的參考指標(biāo)之一，直接影響肉的色澤、水分損失、保藏性等。由表1可知，隨貯藏時間延長，冷鮮羊肉pH值整體呈現(xiàn)先上升然后趨于穩(wěn)定的變化趨勢，與張福生等結(jié)果一致。

表1 冷鮮羊肉貯藏期間色澤、pH值的變化Table 1 Changes in color parameters and pH value of chilled mutton during storage

肉色是消費者選擇羊肉最主要的參考依據(jù)，通?？梢愿鶕?jù)樣品的、*和判斷肉色好壞。隨著貯藏時間的延長，冷鮮羊肉、*、整體均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。

2.1.2 冷鮮羊肉貯藏期間TBARs值變化

長期冷藏通常會導(dǎo)致肉中脂肪氧化，這是導(dǎo)致肉酸敗變質(zhì)和顏色發(fā)生褐變的重要原因之一。本研究對冷鮮羊肉的脂肪氧化情況（2-硫代巴比妥酸法）進行分析，由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，冷鮮羊肉TBARs值整體呈現(xiàn)上升趨勢，貯藏0～17 d上升不顯著，說明貯藏前期羊肉脂肪氧化不明顯，新鮮程度較高，這與貯藏前期冷鮮羊肉呈現(xiàn)亮紅色澤的結(jié)果一致。貯藏17 d后，冷鮮羊肉TBARs值呈現(xiàn)指數(shù)型上升趨勢 （＜0.05），貯藏結(jié)束（21 d）時，冷鮮羊肉的TBARs值達到最高（＜0.05）。

圖1 冷鮮羊肉貯藏期間TBARs值變化Fig. 1 Change in TBARs value in chilled mutton during storage

2.1.3 冷鮮羊肉貯藏期間菌落總數(shù)、TVB-N含量變化

圖3 冷鮮羊肉貯藏期間TVB-N含量變化Fig. 3 Change in TVB-N content of chilled mutton during storage

由圖2～3可知，隨著貯藏時間的延長，冷鮮羊肉菌落總數(shù)、TVB-N含量整體均呈現(xiàn)上升趨勢。在冷鮮羊肉貯藏期間，菌落總數(shù)初始值為2.95（lg（CFU/g）），貯藏前13 d，其菌落總數(shù)上升不顯著；當(dāng)貯藏到15 d時，菌落總數(shù)進入快速增長期，顯著升高（＜0.05），并于17 d時達到6.17（lg（CFU/g）），且超過行業(yè)標(biāo)準 NY/T 632—2002《冷卻豬肉》中規(guī)定的6（lg（CFU/g））。 冷鮮羊肉貯藏期間，TVB-N含量初始值為10.4 mg/100 g，貯藏前11 d，TVB-N含量上升不顯著；當(dāng)貯藏到17 d時冷鮮羊肉TVB-N含量達到15.17 mg/100 g，且超過國家標(biāo)準GB 2707—2016中規(guī)定的15 mg/100 g；貯藏17～21 d，TVB-N含量呈指數(shù)型升高（＜0.05），實驗結(jié)束（21 d）時達到27.22 mg/100 g；與菌落總數(shù)變化趨勢基本一致。本研究中冷鮮羊肉的TVB-N含量與菌落總數(shù)變化規(guī)律大致表現(xiàn)為菌落總數(shù)增長至一定程度時，TVB-N含量進入快速積累狀態(tài)，這與孫武亮等結(jié)果一致。綜上所述，冷鮮羊肉貯藏期間色澤、菌落總數(shù)、TVB-N含量等新鮮度指標(biāo)變化結(jié)果一致，肉中蛋白質(zhì)、脂肪逐漸發(fā)生氧化分解，顏色發(fā)生褐變，進而引起新鮮度下降；在（0.0±0.5） ℃空氣密封包裝條件下，冷鮮羊肉貨架期長達17 d。

圖2 冷鮮羊肉貯藏期間菌落總數(shù)變化Fig. 2 Change in TVC in chilled mutton during storage

2.2 冷鮮羊肉貯藏期間二甲胺、三甲胺含量變化

2.2.1 冷鮮羊肉貯藏期間二甲胺含量變化

由圖4可知，隨著貯藏時間的不斷延長，冷鮮羊肉中二甲胺含量整體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，貯藏0～1 d時，肉中二甲胺含量顯著升高（＜0.05），貯藏1～3 d時顯著降低（＜0.05），貯藏至9 d后趨于穩(wěn)定。而包裝盒中二甲胺含量在貯藏0～1 d顯著上升（＜0.05），貯藏5～9 d時上升不顯著，貯藏11～17 d時顯著升高 （＜0.05），貯藏19～21 d趨于穩(wěn)定。

圖4 冷鮮羊肉貯藏期間二甲胺含量變化Fig. 4 Change in dimethylamine content in chilled mutton during storage

2.2.2 冷鮮羊肉貯藏期間三甲胺含量變化

由圖5可知，隨著貯藏時間的不斷延長，肉中、包裝中三甲胺含量整體均呈現(xiàn)上升趨勢。冷鮮羊肉在貯藏0～1、3～5、9～11 d期間，三甲胺含量顯著升高 （＜0.05），13～19 d上升不顯著，貯藏結(jié)束（21 d）時，三甲胺含量達到最高（15.61 μg/g）（＜0.05）。包裝盒中三甲胺含量在貯藏0～11 d上升不顯著，13～15 d時顯著升高（＜0.05），17～21 d上升不顯著，貯藏結(jié)束（21 d）時，包裝盒中三甲胺含量達到最高（0.051 μg/mL） （＜0.05）。對比冷鮮羊肉中二甲胺含量結(jié)果，三甲胺含量明顯更高，同時有研究表明，肉類腐敗所產(chǎn)眾多氣體中，三甲胺含量占比高達33%，因此，將三甲胺作為肉類新鮮度的鑒定指標(biāo)更具潛力。

圖5 冷鮮羊肉貯藏期間三甲胺含量變化Fig. 5 Change in trimethylamine content in chilled mutton during storage

2.3 三甲胺、二甲胺含量與冷鮮羊肉新鮮度各指標(biāo)間的相關(guān)性

為進一步明確三甲胺和二甲胺含量隨冷鮮羊肉新鮮度的變化規(guī)律，對冷鮮羊肉貯藏期間肉中和包裝中三甲胺、二甲胺含量以及新鮮度各指標(biāo)之間進行相關(guān)性分析。由圖6可知，肉中三甲胺含量及包裝中三甲胺含量均與菌落總數(shù)、TVB-N含量、TBARs值呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.86、0.75、0.74和0.92、0.96、0.95。肉中二甲胺含量與菌落總數(shù)、TVB-N含量、TBARs值均呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.85、-0.58、-0.60，而包裝中二甲胺含量與菌落總數(shù)、TVB-N含量、TBARs值均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.90、0.74、0.65。上述結(jié)果表明，三甲胺、二甲胺含量均可用于表征本研究條件下的冷鮮羊肉新鮮度，且包裝中三甲胺、二甲胺含量與菌落總數(shù)、TVB-N含量、TBARs值的相關(guān)系數(shù)均高于肉中三甲胺、二甲胺含量與菌落總數(shù)、TVB-N含量、TBARs值的相關(guān)系數(shù)，包裝中三甲胺含量與菌落總數(shù)、TVB-N含量、TBARs值的相關(guān)系數(shù)高于包裝中二甲胺含量與三者間的相關(guān)系數(shù)，進一步確證了包裝中三甲胺可以作為冷鮮羊肉在該實驗條件下的標(biāo)志氣體物質(zhì)，具有表征冷鮮羊肉新鮮度的能力。

圖6 三甲胺、二甲胺含量與各新鮮度指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)Fig. 6 Correlation coefficients between trimethylamine and dimethylamine contents and each freshness index

3 討 論

3.1 冷鮮羊肉貯藏期間新鮮度變化

在貯藏前期冷鮮羊肉呈現(xiàn)亮紅色澤，這主要是由于肉中脫氧肌紅蛋白與O結(jié)合生成氧合肌紅蛋白所致，而隨貯藏時間的延長，冷鮮羊肉中氧合肌紅蛋白在活性氧作用下會被氧化生成褐色的高鐵肌紅蛋白，隨著高鐵肌紅蛋白含量的積累，冷鮮羊肉變成暗紅色，失去光澤。 在貯藏期間，肉表面滲水使肉樣對光的反射能力增強，*增大，后續(xù)由高鐵肌紅蛋白的積累及脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的自由基與肉中胺類物質(zhì)反應(yīng)生成黃色素，使*降低，色澤變暗，肉表面失去光澤。*和氧合肌紅蛋白與肌紅蛋白的相對比值有關(guān)，比值越大，*越大，也有研究表明，*在貯藏15 d后達到最大，隨后逐漸降低，這與肉中微生物的繁殖及水分損失有關(guān)。且隨貯藏時間的延長，肉中脂肪氧化程度增加，其中含有的不飽和脂肪酸氧化生成的自由基會加速肌紅蛋白的氧化，引起肉表面褪色，肉感官品質(zhì)下降。

肉中含有大量的微生物，在冷藏條件下細菌中的各種酶活性雖然受一定影響，但仍易使脂肪、蛋白質(zhì)等出現(xiàn)一定程度的分解，產(chǎn)生氨、胺類等含氮的堿性有毒物質(zhì)，它們以TVB-N的形式存在于肉中，隨著貯藏時間的延長，胺類等代謝物積累導(dǎo)致冷鮮羊肉的TVB-N含量和菌落總數(shù)在貯藏過程中顯著上升。pH值上升主要可能是由于分解代謝消耗了肌肉中所積累的酸性物質(zhì)。TBARs值也隨之不斷上升，主要是由于不飽和脂肪酸在氧的作用下發(fā)生氧化生成的醛和酮所致，而隨貯藏時間的延長，冷鮮羊肉中微生物數(shù)量不斷增加，羊肉脂肪氧化速率加快，氧化程度加深。本研究中冷鮮羊肉菌落總數(shù)和TVB-N含量在17 d時分別達到6.17（lg（CFU/g）） 和15.17 mg/100 g，二者均超過國家標(biāo)準規(guī)定的限值。因此，從以上新鮮度指標(biāo)可以綜合判斷本次實驗（0.0±0.5） ℃貯藏條件下，冷鮮羊肉的貯藏期為17 d。

3.2 冷鮮羊肉貯藏期間二甲胺、三甲胺含量變化

三甲胺和二甲胺是肉類及水產(chǎn)品中常見的揮發(fā)性胺，冷鮮羊肉貯藏前期肉中與包裝中二甲胺含量均呈增加趨勢，這主要與肉中氧化三甲胺的分解有關(guān)，隨著貯藏時間延長，微生物的數(shù)量增加，分泌出大量的酶分解氧化三甲胺，導(dǎo)致二甲胺含量增加，肉中二甲胺隨著貯藏時間的延長不斷逸出，包裝盒中二甲胺氣體含量不斷上升。而貯藏后期肉中與包裝盒中二甲胺氣體含量具有不一致的變化趨勢，肉中二甲胺含量下降，這主要是由于羊肉在貯藏期間肌肉纖維結(jié)構(gòu)逐漸破壞，肌纖維間距離增大，其間的空隙不利于二甲胺滯留所致。三甲胺含量呈現(xiàn)顯著上升主要是由于肉中天然存在三甲胺、氧化三甲胺以及三甲胺的產(chǎn)生有助于TVB-N含量的增長，但隨著貯藏時間的延長，在微生物和酶的作用下，蛋白質(zhì)、氨基酸降解程度增加，脫氨反應(yīng)加劇，以及非蛋白質(zhì)氮化合物的積累使得TVB-N含量在后期才顯著增加，且TVB-N含量的增加總是滯后的。肉中三甲胺隨著貯藏時間的延長不斷逸出，使得包裝盒中三甲胺氣體含量不斷上升，主要是由于隨著貯藏時間的延長，微生物含量不斷增加，氧化三甲胺不斷降解成三甲胺所致。

4 結(jié) 論

冷鮮羊肉貯藏期間，肉中蛋白質(zhì)、脂肪逐漸發(fā)生氧化分解，顏色發(fā)生褐變，失去光澤，進而引起新鮮度下降，在（0.0±0.5） ℃空氣密封包裝條件下，冷鮮羊肉貨架期長達17 d。進一步通過相關(guān)分析，證實三甲胺、二甲胺含量與菌落總數(shù)、TVB-N含量、TBARs值均具有較強的相關(guān)性，且三甲胺的相關(guān)性更好，包裝中三甲胺氣體含量與菌落總數(shù)、TVB-N含量、TBARs值的相關(guān)系數(shù)均達到0.92以上，確證了三甲胺更適于表征與評價本研究條件下冷鮮羊肉新鮮度。