蘇學(xué)軍，裘可，范文赟

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇泰州 225300）

蕎麥殼是加工蕎麥粉時(shí)產(chǎn)生的主要副產(chǎn)品，約占蕎麥總重量的1/3（張嵐等，2016）。長(zhǎng)久以來(lái)，蕎麥殼除少量用作土壤基肥、輔助飼料及枕芯填充物外（印鑫等，2018），其余被視為農(nóng)業(yè)廢棄物而遭拋棄。研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥殼中含有多種生物活性物質(zhì)，作為主要成分之一的蕎麥殼黃酮（FOBH）具有預(yù)防和治療糖尿病、清除自由基、調(diào)節(jié)脂肪代謝、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、改善微循環(huán)等功效（李鵬程等，2017；王昱儒等，2017；路靜靜等，2016；Ren等，2003）。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，黃酮是一種多功能性飼料添加劑，可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和生產(chǎn)，增強(qiáng)機(jī)體免疫及抗氧化能力，提高畜禽繁殖性能（劉瑞雪等，2021；劉帥等，2021）。研究表明，在AA 肉仔雞日糧中添加750 mg/kg 艾蒿黃酮，喂飼22～ 42 d，能極顯著提高肉仔雞的平均日增重，降低料重比，改善肉品質(zhì)（江陽(yáng)等，2021）；給肉仔雞飼喂適量的黃芪黃酮，可以改善腸道的微生物菌群，促進(jìn)腸道健康（梁英等，2012）；甘草黃酮可作為替抗產(chǎn)品用于產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的雞壞死性腸炎的治療（劉宗爭(zhēng)等，2019）；妊娠母豬飼料中添加200 mg/kg大豆黃酮可顯著增加仔豬的初生窩重和窩健仔數(shù)，顯著提高妊娠母豬的血清IgG 含量及SOD 活性，增強(qiáng)母豬的抗氧化能力（張琦琦等，2019）。因此，探索一種安全高效的FOBH 提取技術(shù)，對(duì)于飼料工業(yè)的發(fā)展具有積極意義。氧化石墨烯（GO）是具有二維片層結(jié)構(gòu)的氧化碳化合物，作為一種新型催化劑，應(yīng)用于天然活性成分提取時(shí)能夠催化水解植物細(xì)胞壁，降低纖維素的結(jié)晶度及晶粒尺寸，提高目標(biāo)組分的浸出速率和提取效率（王博文等，2017；王欣，2015）。目前，關(guān)于GO 輔助乙醇提取FOBH 的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因而本試驗(yàn)設(shè)計(jì)單因素及正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在提供一種FOBH 提取新技術(shù)，亦為蕎麥殼資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 甜蕎麥殼，泰州市永安洲；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；單層氧化石墨烯，蘇州恒球科技有限公司；醋酸鈉、三氯化鋁與無(wú)水乙醇均為市售分析純。

1.2 主要試驗(yàn)儀器 BJ-150 多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）；TDL-60B 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TU-1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析儀器有限公司）；HH-S1 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；LRH-250F 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 FOBH 的提取 取60 ℃下鼓風(fēng)烘干后的蕎麥殼若干，粉碎過(guò)40 目篩，干粉密封于干燥器內(nèi)備用。稱(chēng)取4 g 蕎麥殼粉末放入三口燒瓶?jī)?nèi)，加入一定量的提取溶劑及GO，在預(yù)設(shè)溫度下，水浴回流提取一定時(shí)間。完成提取后，以4000 r/min 離心分離15 min，得到含F(xiàn)OBH 的上清液，收集后待測(cè)。

1.3.2 FOBH 提取量的測(cè)定 參考曾俊等（2020）采用的AlCL3比色法測(cè)定FOBH 的提取量。精密移取質(zhì)量濃度為201 μg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于25 mL 比色管中，再分別移入1.5%的AlCL3溶液4 mL，1 mol/L NaAc 溶液4 mL，繼續(xù)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的乙醇至刻度，顯色反應(yīng)20 min，在415 nm 處測(cè)定系列顯色液的吸光度，得吸光度A 與蘆丁濃度C 之間的回歸方程為A=0.0301C+0.0411，R2=0.9995。精密移取1 mL 蕎麥殼提取液，按前述步驟加入顯色劑顯色，測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液中FOBH 濃度，并按下式計(jì)算FOBH 提取量。

式中：Y 為FOBH 提取量，mg/g；K 為稀釋倍數(shù)；C 為計(jì)算求出的提取液中FOBH 的濃度，μg/mL；V 為提取劑的體積，mL；m 為蕎麥殼干粉的質(zhì)量，g。

1.3.3 GO 輔助乙醇提取FOBH 的單因素試驗(yàn)以FOBH 的提取量為指標(biāo)，研究提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、提取溫度（50、60、70、80、90℃）、GO 添加量（0、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/g）、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%）和料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）對(duì)提取量的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取提取溫度、GO 添加量、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比作為四因素，基于L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案并優(yōu)化提取工藝條件，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)Excel 2017 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析，Duncan’s 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)比 采用水提（WE ）、GO 輔助水提（GOWE ）、醇提（ET）、GO 輔助醇提（GOET）4種方法提取FOBH。提取溶劑為蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%乙醇，料液比1:20 g/mL，GO 添加量0.4 mg/g，70 ℃水浴回流提取1.5 h。由圖1 可知，乙醇用作提取劑更利于FOBH 的溶出，且在提取劑中添加GO后，水提和醇提獲得的黃酮提取量均有一定程度的增加，但以GOET 法效果最好。因此，采用GOET 法提取FOBH，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝條件。

圖1 不同提取方法對(duì)比

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)FOBH 提取量的影響 由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，在1.5 h 之前提取量上升較快，至1.5 h 后趨于平緩。這是因?yàn)樘崛〕跗邳S酮在細(xì)胞壁內(nèi)外有較大的濃度差，擴(kuò)散速度快，但當(dāng)提取達(dá)一定時(shí)間后，提取劑中FOBH 的濃度趨于飽和，提取量就變化不大，綜合考慮選擇1.5 h 比較經(jīng)濟(jì)。

圖2 提取時(shí)間對(duì)FOBH 提取量的影響

2.2.2 提取溫度對(duì)FOBH 提取量的影響 由圖3可知，提取量隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度到達(dá)80 ℃后，提取量有所減小。升高溫度可增大傳質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)，降低相際傳質(zhì)阻力，使得黃酮更易增溶于提取劑中。但若提取溫度過(guò)高，非目標(biāo)組分的溶出增多，且有可能會(huì)影響黃酮的穩(wěn)定性，故適宜的提取溫度選為80 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)FOBH 提取量的影響

2.2.3 GO 添加量對(duì)FOBH 提取量的影響 圖4表明，隨著GO 添加量的增多，F(xiàn)OBH 的提取量先增大后減小，其最大值出現(xiàn)在GO 添加量為1.2 mg/g時(shí)，說(shuō)明GO 能在一定濃度范圍內(nèi)提高目標(biāo)物的得率。這可能是由于熱回流提取時(shí)，GO 片狀結(jié)構(gòu)的鋒利側(cè)邊會(huì)不斷切割、刺入細(xì)胞壁（涂育松等，2016），而遭到物理破壞的細(xì)胞壁則容易被提取劑穿透。同時(shí)，GO 表面大量的酸性基團(tuán)，能使細(xì)胞壁的骨架成分纖維素發(fā)生水解（王博文等，2017），溶出阻力大大降低，加快了細(xì)胞內(nèi)黃酮的釋放。但GO 的比表面積大，提取時(shí)若GO 量過(guò)多，會(huì)造成GO 對(duì)FOBH 的吸附量增加，導(dǎo)致提取量降低，故GO 添加量選擇1.2 mg/g 為宜。

圖4 GO 添加量對(duì)FOBH 提取量的影響

2.2.4 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)FOBH 提取量的影響 圖5 表明，F(xiàn)OBH 的提取量隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大，在50%時(shí)達(dá)到最大值，之后提取量降低。這可能是由于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%乙醇溶液的極性與FOBH 的極性最為相似，黃酮在此濃度下更易溶出。因此，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的乙醇提取較為合適。

圖5 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)FOBH 提取量的影響

2.2.5 料液比對(duì)FOBH 提取量的影響 由圖6 可見(jiàn)，當(dāng)料液比為1:10～1:15 g/mL時(shí)，提取量呈上升趨勢(shì)。料液比增大后，蕎麥殼粉與提取劑之間的接觸更充分，有利于FOBH 的溶出。但料液比的增大，會(huì)使提取劑中GO 濃度降低，從而削弱GO的催化作用，提取量又表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，故料液比選擇1:15 g/mL 較適宜。

圖6 料液比對(duì)FOBH 提取量的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表2 可以看出，各因素對(duì)FOBH 提取量的影響大小順序?yàn)锳（提取溫度）>D（料液比）>B（GO 添加量）>C（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。由表3 可知，4 個(gè)因素對(duì)提取量的影響均表現(xiàn)為極顯著。本試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳工藝組合為A3B2C1D3，即提取溫度90 ℃，GO 添加量1.2 mg/g，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%，料液比1:20 g/mL。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了驗(yàn)證提取工藝的穩(wěn)定性，在最佳工藝組合A3B2C1D3條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，得到FOBH 提取量的平均值為（7.39±0.02）mg/g，RSD 為0.33%，表明該工藝穩(wěn)定可行。在上述最優(yōu)提取工藝條件下，若不添加GO，進(jìn)行3 次乙醇回流提取，提取量平均值為（6.20±0.03）mg/g，GO 輔助醇提取后提取量增大了1.19 mg/g。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，氧化石墨烯輔助乙醇提取FOBH 的最優(yōu)工藝條件為：提取溫度90 ℃，GO 添加量1.2 mg/g，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%，料液比1:20 g/mL，提取時(shí)間1.5 h。此條件下，F(xiàn)OBH 的提取量為7.39 mg/g，比乙醇回流提取提高了1.19 mg/g，表明GO 輔助乙醇提取FOBH 工藝的高效性。本工藝研究為FOBH 開(kāi)發(fā)成飼料添加劑提供了可能，同時(shí)為蕎麥殼資源的綜合利用提供了一定的理論依據(jù)。