羅星雨，轉 黎，胥 琴，田冀雯，馬艷萍*

0 引言

宮腔粘連是指女性子宮內膜基底層受損，子宮內膜恢復障礙，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)異常、閉經(jīng)、流產、不孕等一系列綜合征[1]。纖維化是宮腔粘連的主要病理改變，不同研究顯示，終止妊娠后宮腔粘連發(fā)生率為8.1%～21.2%[2-4]。目前針對宮腔粘連的治療最常采用和最有效的方法是宮腔鏡下粘連分解術加術后雌、孕激素治療，該方法在改善月經(jīng)和提高妊娠率方面具有重要作用，但有部分研究表明，重度宮腔粘連的復發(fā)率可高達63%左右[5-6]。因此，尋找新的治療藥物及治療方法仍然十分重要。有大量研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素轉化酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)可以通過降低血管緊張素Ⅱ水平，從而調節(jié)體內TGFβ相關的mRNA水平，延緩多種器官纖維化進展，目前發(fā)現(xiàn)，ACEI類藥物鹽酸貝那普利可以通過調節(jié)TGF-β參與的信號通路延緩腎、肝、肺等器官的纖維化進展[7-10]，TGF-β作為始動因子主要參與TGF-β1-smad2/smad3信號通路途徑，當損傷發(fā)生時TGF-β表達增加，該信號通路活化，纖維化發(fā)生[11-12]。本研究選取人子宮內膜上皮細胞(AN3CA)及人子宮內膜間質細胞(hESC)，用TGF-β1誘導其纖維化改變，給予鹽酸貝那普利治療，觀察鹽酸貝那普利對TGF-β1誘導的AN3CA細胞及hESC細胞纖維化改變的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 TGF-β1蛋白購于Sinobiological公司；鹽酸貝那普利、Cell Counting Kit-8(CCK8)購于MedChemExpress公司；AN3CA細胞、hESC細胞購于賽百慷生物技術股份有限公司(中國上海)；MEM培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、0.25% Trypsin-EDTA購于GIBCO公司(美國)；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于Solarbio公司；CellTiter-Glo細胞活力檢測系統(tǒng)購于Promega公司；Anti-Fibronectin antibody ab2413抗體、Anti-TGFβ1 antibody ab170874抗體購于Abcam公司；Smad3(C67H9)Rabbit mAb 9523抗體購于Cell Signaling Technology公司；KPL CyTM3-Labeled Antibody to Rabbit IgG(H+L)二抗購于Seracare公司；熒光倒置顯微鏡(Carl zeiss Microscopy GmbH，型號：Axio Scope A1)；流式細胞儀(BD公司，型號：JANUARY 2007)；酶標儀(BioTek公司，型號：ELX800)。

1.2 實驗方法

1.2.1 預實驗和實驗分組 預實驗用CCK8檢測TGF-β1對AN3CA細胞的50%抑制率(IC50)，將細胞接種于96孔板，與不同濃度的TGF-β1共培養(yǎng)，按CCK8說明書方法進行細胞增殖活力測定，分別在24 h、48 h、72 h檢測細胞增殖活力；用CCK8檢測鹽酸貝那普利對AN3CA細胞的安全濃度，將細胞接種于96孔板，與不同濃度的鹽酸貝那普利共培養(yǎng)，按CCK8說明書方法進行細胞增殖活力測定，分別在24 h、48 h、72 h檢測細胞增殖活力。將凍存的AN3CA細胞及hESC細胞復蘇后，AN3CA細胞培養(yǎng)于MEM(含10%FBS)培養(yǎng)基，hESC細胞培養(yǎng)于DMEM/F-12(含10%FBS)培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件37 ℃，5%CO2。細胞傳代2次正常培養(yǎng)24 h后,將其分為對照組、實驗組、BNPL5組和BNPL8組，對照組更換正常培養(yǎng)基(含10%FBS)，實驗組更換含TGF-β1 5 ng/ml的培養(yǎng)基(含10%FBS)，BNPL5組更換含TGF-β1(5 ng/ml)+貝那普利(5 μmol/L)的培養(yǎng)基(含10%FBS)，BNPL8組更換含TGF-β1(5 ng/ml)+貝那普利(8 μmol/L)的培養(yǎng)基(含10%FBS)，AN3CA細胞培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)，hESC細胞培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng)。

1.2.2 細胞形態(tài)學觀察 用倒置相差顯微鏡觀察細胞數(shù)量、細胞生長情況以及細胞形態(tài)改變。

1.2.3 CellTiter-Glo法測定細胞活力 按說明書方法測定細胞增殖活力，分別在0 h、24 h、48 h和72 h檢測細胞增殖活力。

1.2.4 細胞凋亡水平檢測 四組細胞終止培養(yǎng)后，制備細胞懸液，按凋亡試劑盒說明書方法應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 免疫熒光法測定纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)含量 將細胞按一定密度接種于24孔板專用細胞爬片，根據(jù)分組給予相應藥物處理后終止培養(yǎng)，按一抗Anti-Fibronectin antibody及二抗KPL免疫熒光說明書方法進行免疫熒光檢測，應用倒置相差熒光顯微鏡觀察及拍攝，用Image J進行免疫熒光圖片定量分析。

1.2.6 Western blot檢測FN、TGF-β1、Smad3蛋白 按BCA蛋白測定試劑盒說明書測定蛋白濃度，并制膠，加樣，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉膜到PVDF膜上，使用5%BSA室溫封閉1.5 h后,加入TGF-β1(1∶1 000)、Smad3(1∶1 000)、Fibronectin(1∶500)和GAPDH(1∶2 000)的抗體在4 ℃孵育過夜，洗膜后用過氧化物酶連接的二抗孵育1.5 h后，用增強化學發(fā)光法顯示蛋白條帶，然后檢測灰度值，采用Image J圖像分析軟件計算目的蛋白的相對表達量，實驗重復3次。

2 結果

2.1 CCK8篩查TGF-β1的IC50及鹽酸貝那普利的安全濃度 AN3CA細胞與TGF-β1共培養(yǎng)48 h時實驗組的抑制率為51%，故取TGF-β1的IC50(5 ng/ml)為實驗組藥物濃度(見表1)。當鹽酸貝那普利的濃度≤8 μmol/L時，AN3CA細胞的存活率基本不受影響，且細胞形態(tài)無改變，生長狀態(tài)好。當濃度>8 μmol/L時，AN3CA細胞的存活率下降，故考慮鹽酸貝那普利的安全濃度≤8 μmol/L，故選取鹽酸貝那普利濃度5 μmol/L和8 μmol/L為治療濃度(見表2)。

表1 CCK8檢測TGF-β1對AN3CA細胞的抑制率(n=3)

表2 CCK8檢測AN3CA細胞的存活率(n=3)

2.2 鹽酸貝那普利對TGF-β1誘導的AN3CA細胞及hESC細胞的形態(tài)學影響 終止培養(yǎng)后，熒光鏡下結果顯示，AN3CA細胞：對照組的細胞生長狀態(tài)好，呈多角形或短梭形，貼壁牢靠，細胞數(shù)量多；實驗組的細胞呈長梭形，纖維化樣外觀，貼壁不牢靠，活細胞數(shù)量較少，死亡細胞較多，細胞間隙大，形態(tài)學改變明顯；BNPL5組的細胞部分恢復為短梭形或多角形，死亡細胞數(shù)較B組減少；BNPL8組的細胞部分恢復為短梭形或多角形，細胞死亡數(shù)較BNPL5組更少(圖1)。hESC細胞：四組細胞形態(tài)均無明顯改變，實驗組細胞數(shù)量增多，BNPL5組細胞數(shù)量較實驗組下降，BNPL8組進一步下降(圖2)。

圖1 AN3CA細胞形態(tài)圖(400×)注：A.對照組；B.實驗組；C.BNPL5組；D.BNPL8組

圖2 hESC細胞形態(tài)圖(400×)注：A.對照組；B.實驗組；C.BNPL5組；D.BNPL8組

2.3 鹽酸貝那普利對TGF-β1誘導的AN3CA細胞及hESC細胞增殖的影響 CellTiter-Glo法根據(jù)上述分組檢測細胞增殖活力：AN3CA細胞用TGF-β1處理后細胞增殖活力下降，實驗組與對照組有顯著性差異，加用貝那普利處理后細胞增殖活力增加，差異無統(tǒng)計學意義(表3)；hESC細胞用TGF-β1處理后增殖活力增加，實驗組與對照組有顯著性差異，加用貝那普利后細胞增殖活力下降，BNPL8組與實驗組在處理72 h差異有統(tǒng)計學意義(實驗組：781 632.3±2 089.2，BNPL8組：668 127±17 293，P<0.001)(表4)。

表3 AN3CA細胞CellTiter-Glo測定結果

表4 hESC細胞CellTiter-Glo測定結果

2.4 鹽酸貝那普利對TGF-β1誘導AN3CA、hESC細胞凋亡的影響 AN3CA細胞：與對照組相比，加用TGF-β1處理后AN3CA細胞凋亡率增加，使用鹽酸貝那普利8 μmol/L處理后細胞凋亡率下降，差異具有統(tǒng)計學意義(表5，圖3)。

圖3 AN3CA細胞凋亡圖注：A.對照組;B.實驗組;C.BNPL5組;D.BNPL8組

表5 AN3CA細胞凋亡率

hESC細胞：與對照組比較，加用TGF-β1處理后細胞凋亡情況無明顯變化。使用鹽酸貝那普利8 μmol/L共培養(yǎng)后，細胞凋亡率增加，差異具有統(tǒng)計學意義(表6，圖4)。

圖4 hESC細胞凋亡圖注：A.對照組；B.實驗組；C.BNPL5組；D.BNPL8組

表6 hESC細胞凋亡率

2.5 鹽酸貝那普利對TGF-β1誘導AN3CA、hESC細胞的FN含量的影響 AN3CA細胞：根據(jù)分組處理4組細胞，終止培養(yǎng)后用免疫熒光法檢測FN表達量，實驗組FN表達量較對照組顯著增加(P<0.001)，BNPL8組表達量較實驗組降低(P<0.001)(表7，圖5)。

表7 AN3CA細胞FN測定表

圖5 AN3CA細胞FN免疫熒光圖(100×)注：A.對照組；B.實驗組；C.BNPL5組；D.BNPL8組

hESC細胞：終止培養(yǎng)后用免疫熒光法檢測FN表達量。實驗組FN表達量較對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義。BNPL8組FN表達量較實驗組降低，差異具有統(tǒng)計學意義(表8，圖6)。

圖6 hESC細胞FN免疫熒光圖(免疫熒光，100×)注：A.對照組;B.實驗組;C.BNPL5組;D.BNPL8組

表8 hESC細胞免疫熒光FN測定表

2.6 鹽酸貝那普利對TGF-β1誘導的AN3CA、hESC細胞的FN、TGF-β1、smad3蛋白含量的影響 根據(jù)分組分別處理4組細胞，終止培養(yǎng)后應用Western blot檢測FN、TGF-β1、smad3的蛋白表達情況，結果顯示，2種細胞實驗組FN、TGF-β1、smad3含量較對照組均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義。BNPL5組、BNPL8組較實驗組FN、TGF-β1、smad3均有明顯降低(表9～表10，圖7～圖8)。

表9 AN3CA細胞Western blot測定表

表10 hESC細胞Western Blot測定表

圖7 AN3CA細胞FN、TGF-β1、smad3的Western blot檢測灰度圖

圖8 hESC細胞FN、TGF-β1、smad3的Western blot檢測灰度圖

3 討論

TGF-β1-smad2/smad3途徑是參與子宮內膜纖維化的主要信號通路之一，TGF-β作為該通路的配體，結合細胞表面的1型和2型受體，即絲/蘇氨酸激酶，觸發(fā)信號轉導至2型受體，使1型受體磷酸化激活R-smad(smad1、2、3、5、8)，R-smad結合到Co-smad的結合位點上，從而使信號分子能跨越細胞核膜，將信息傳遞到細胞核內，從而調節(jié)目的基因的轉錄[13]，正常情況下該通路維持一個動態(tài)平衡，TGF-β1為該通路的始動因子，smad3是該信號通路的下游因子。有研究發(fā)現(xiàn)，應用SD大鼠進行宮腔搔刮構建宮腔粘連模型后，其TGF-β1及smad3蛋白表達增加，表明smad3蛋白的過度表達在子宮內膜纖維化進展中可能發(fā)揮重要作用[14]；纖維連接蛋白(FN)是細胞外基質的主要纖維成分之一，目前發(fā)現(xiàn)子宮內膜上皮細胞及子宮內膜間質細胞均可分泌纖維連接蛋白，其中間質細胞分泌纖維連接蛋白的作用更加明顯，它們的共同作用參與子宮內膜纖維化的進展；目前，纖維連接蛋白被認為是纖維化程度的判斷因子[15]，當子宮內膜纖維化發(fā)生時，上皮細胞-間質化的比例增加，上皮細胞轉化為間充質細胞，其分泌纖維連接蛋白的能力隨之增加，稱為上皮-間充質轉換(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)，EMT有助于纖維化的發(fā)展[16]。

目前大量研究認為,血管緊張素II(Angiotensin II,ATII)可能作為TGF-β1-smad2/smad3信號通路的上游因子調控纖維化[17-18]，并且有大量研究證明ACEI類藥物可以通過TGF-β1參與的信號通路改善腎、肺、肝等臟器的纖維化[7-9,19]。本實驗應用TGF-β1誘導AN3CA細胞及hESC細胞纖維化，并給予鹽酸貝那普利作用于2種細胞，擬探索ACEI類藥物鹽酸貝那普利對人子宮內膜細胞纖維化的影響。結果顯示，AN3CA細胞用TGF-β1處理后，細胞形態(tài)呈纖維化樣改變，細胞活力降低，用貝那普利處理后，細胞活力部分恢復(雖然CellTiter-Glo顯示并無統(tǒng)計學意義，但可以看到使用鹽酸貝那普利后細胞的增殖活力呈現(xiàn)上升趨勢)，細胞形態(tài)部分逆轉，F(xiàn)N、TGF-β1以及smad3蛋白在給予鹽酸貝那普利治療后表達量均較TGF-β1損傷組顯著下降；用TGF-β1誘導hESC細胞后細胞形態(tài)無改變，但細胞增殖活力增強，鹽酸貝那普利抑制了TGF-β1處理后的hESC細胞增殖活力(CellTiter-Glo顯示，使用鹽酸貝那普利后細胞的增殖活力下降，且具有統(tǒng)計學意義)，增加了該細胞的凋亡水平，并且鹽酸貝那普利治療組FN、TGF-β1以及smad3蛋白表達量均顯著低于TGF-β1處理組。子宮內膜主要由腺體發(fā)揮正常生物學功能，腺體由子宮內膜上皮細胞構成，子宮內膜上皮細胞參與子宮內膜的再生和修復，有利于抵抗炎癥和纖維化，而子宮內膜間質細胞主要參與炎癥、纖維化的發(fā)展。本結果顯示，TGF-β1可降低AN3CA細胞的增殖活性，增加凋亡，降低其正常生物學活性，使子宮內膜上皮細胞發(fā)生炎癥和纖維化；TGF-β1誘導后，hESC細胞的增殖活性增加，使其參與炎癥和纖維化進展的功能增強。因此，本研究證明，TGF-β1同時促進了AN3CA細胞和hESC細胞的纖維化進展。鹽酸貝那普利可以通過促進TGF-β1損傷后的AN3CA細胞的增殖活力降低其凋亡水平，并降低FN、TGF-β1、smad3蛋白表達水平，從而保護TGF-β1誘導纖維化的AN3CA細胞，延緩其纖維化進展；同時鹽酸貝那普利可以通過抑制TGF-β1處理后hESC細胞的增殖活力增加其凋亡水平，并降低其FN、TGF-β1、smad3蛋白表達水平，從而降低hESC細胞的生物學功能，延緩其纖維化進展。因此，研究證明鹽酸貝那普利同時改善了AN3CA細胞及hESC細胞的纖維化改變。

宮腔操作后子宮內膜損傷是臨床上宮腔粘連的主要原因，在宮腔操作前或操作后給予患者安全濃度的貝那普利處理，是否可以降低患者的宮腔粘連率仍需要進一步探索。