潘韶英，朱 斌，王素麗，丁志勇，趙文理

0 引言

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)為惡性克隆性漿細(xì)胞病，常累及骨、腎、血細(xì)胞甚至神經(jīng)系統(tǒng)[1-2]。近年來(lái)，新型藥物(如蛋白酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)藥物)的廣泛使用使多發(fā)性骨髓瘤患者的治療反應(yīng)率大幅提高，但難以長(zhǎng)期維持，幾乎所有患者最終都會(huì)出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)及耐藥，大部分患者死于并發(fā)癥[3-4]。三氧化二砷(Arsenic trioxide,ATO)最早在我國(guó)用于急性早幼粒細(xì)胞白血病。近年研究發(fā)現(xiàn)，ATO在非急性早幼粒細(xì)胞白血病、淋巴瘤、多種實(shí)體腫瘤及多發(fā)性骨髓瘤中具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力[5-7]。此外，ATO可調(diào)控多種腫瘤相關(guān)信號(hào)通路及靶基因[8-9]，表明ATO對(duì)MM治療具有較好的臨床應(yīng)用前景。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA-NEAT1在MM的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[10-11]。有文獻(xiàn)報(bào)道NEAT1與腫瘤化療藥物抵抗有關(guān)[12]。本研究擬闡述ATO對(duì)MM細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的作用，并探究NEAT1及相關(guān)通路在此過(guò)程中作用，為ATO潛在臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 OPM2、KM3細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，U266、RPMI8226細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。RMPI1640高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞用青霉素和鏈霉素、RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、鼠抗人GAPDH單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠及抗兔二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；總RNA分離提取試劑TRIzol、siRNA轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Millipore公司。蛋白一抗均購(gòu)自CST公司。引物、siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。ATO購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞試驗(yàn)分為2組，①NEAT1敲減組：對(duì)KM3細(xì)胞進(jìn)行NEAT1特異性siRNA轉(zhuǎn)染，減低NEAT1表達(dá)水平；②對(duì)照組：對(duì)KM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性siRNA，作為對(duì)照。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 骨髓瘤細(xì)胞OPM2、U266、RPMI8226及KM3培養(yǎng)于RPMI 1640含10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于27 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用RPMI 1640稀釋ATO，并配制為5、15、20 μM終濃度工作液，與細(xì)胞孵育培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔濃度接種96孔板，次日更換含不同濃度ATO的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量該樣品在450 nm處的吸光度值。

×100%

1.2.4 RNA提取及基因表達(dá)檢測(cè) 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。Real-time定量PCR條件為：95 ℃ 10 min后,95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。Real-time定量PCR使用ABI 7500儀器進(jìn)行。根據(jù)待測(cè)標(biāo)本的Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)倍數(shù)變化。其中各基因引物如下：NEAT1：F:5′-ATGCCACAACGCAGATTGAT-3′，R:5′- CGAGAAACGCACAAGAAGG-3′。Notch1：F:5′- GAGGCGTGGCAGACTATGC-3′，R:5′-CTTGTACTCCGTCAGCGTGA-3′。Jag2：F:5′-TGGGCGGCAACTCCTTCTA-3′，R:5′-GCCTCCACGATGAGGGTAAA-3′。ADAM10：F:5′-ATGGGAGGTCAGTATGGGAATC-3′，R:5′-ACTGCTCTTTTGGCACGCT-3′。PRKD2：F:5′-GAAAGCGGCACTATTGGCG-3′，R:5′-ACTCCACCGTGAGGATTTCTG-3′。GAPDH： F:5′-GACCTGACCTGCCGTCTA-3′，R:5′-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3′。

1.2.5 NEAT1敲減實(shí)驗(yàn) siRNA陰性對(duì)照序列5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。NEAT1特異性2條siRNA序列如下。siNEAT1-1：5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAACUUU-3′，siNEAT1-2：5′-UGAUGGAGACGGAGCUGAAUU-3′。siRNA轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞株按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在KM3細(xì)胞中敲減NEAT1，利用qPCR檢測(cè)2條siRNA敲減效率，發(fā)現(xiàn)與陰性siRNA對(duì)照比較，空轉(zhuǎn)細(xì)胞NEAT1表達(dá)(1.08±0.061vs.1.00±0.083，t=1.792,P=0.245)無(wú)明顯差異；siNEAT1-1敲減組細(xì)胞NEAT1表達(dá)(0.51±0.035vs.1.00±0.083，t=10.98,P<0.001)顯著減低；siNEAT1-2敲減組細(xì)胞NEAT1表達(dá)(0.20±0.016vs.1.00±0.083,t=17.79,P<0.001)顯著減低；同時(shí),siNEAT1-2敲減效率更高，后續(xù)研究以siNEAT1-2細(xì)胞作為NEAT1敲減組細(xì)胞研究。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。取5～10萬(wàn)重懸的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，使用鋁箔避光。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC 為綠色熒光(為凋亡圖橫坐標(biāo))，碘化丙啶為紅色熒光(為凋亡圖縱坐標(biāo))。計(jì)算細(xì)胞總凋亡率=早期凋亡細(xì)胞百分率+晚期凋亡細(xì)胞百分率。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot,WB)檢測(cè)研究蛋白的表達(dá) 采用RIPA裂解每組樣品抽提總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量。每組細(xì)胞取50 μg蛋白上樣，在10%的SDS-PAGE中進(jìn)行電泳2 h，然后將蛋白轉(zhuǎn)膜至甲醇預(yù)處理的PVDF膜1 h，以5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，次日PBST漂洗3次，每次10 min，加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，PBST漂洗3次，每次10 min后，用ECL化學(xué)發(fā)光液曝光顯色，利用Image J 1.8.0分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 ATO不同敏感性骨髓瘤細(xì)胞的NEAT1表達(dá)比較 如表1所示，各種骨髓瘤細(xì)胞對(duì)ATO的抑制率顯著不同。與0 μM ATO處理比較，各骨髓瘤細(xì)胞均在15 μM ATO處理下出現(xiàn)顯著抑制，且ATO對(duì)各種骨髓瘤細(xì)胞抑制率由大到小(敏感性)順序?yàn)椋篛PM2>RPMI8226>U266>KM3。

表1 骨髓瘤細(xì)胞在不同濃度ATO培養(yǎng)下的抑制率(中位數(shù))比較(n=5)

利用qPCR檢測(cè)，以O(shè)PM2為對(duì)照組細(xì)胞，OPM2的NEAT1相對(duì)表達(dá)倍數(shù)為1.00±0.062(n=3)，U266為1.73±0.13(n=3)，RPMI8226為3.45±0.43(n=3)，KM3為6.91±0.17(n=3)，其中KM3細(xì)胞株表達(dá)NEAT1含量最高，ATO敏感性最差，以此細(xì)胞株作為后續(xù)研究對(duì)象。

鑒于KM3細(xì)胞在15 μM ATO處理下出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，因此選擇15 μM ATO濃度處理。利用qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：處理細(xì)胞NEAT1表達(dá)倍數(shù)顯著低于未處理細(xì)胞(0.54±0.059vs.1.00±0.25,t=3.09,P=0.037，n=3)，表明ATO可顯著下調(diào)NEAT1表達(dá)。

2.2 NEAT1敲減組KM3細(xì)胞與對(duì)照組KM3細(xì)胞在不同濃度ATO處理下的抑制率比較 與對(duì)照組細(xì)胞相比，NEAT1敲減組KM3細(xì)胞ATO敏感性顯著增加。對(duì)照組細(xì)胞在15 μM ATO處理下出現(xiàn)抑制，而敲減組細(xì)胞5 μM即出現(xiàn)明顯抑制，并且各藥物濃度下的抑制率也大幅增加，詳見(jiàn)表2。

表2 KM3對(duì)照組細(xì)胞及NEAT1敲減組細(xì)胞在不同ATO濃度處理下抑制率比較(n=5)

2.3 NEAT1敲減組KM3細(xì)胞與對(duì)照組KM3細(xì)胞在不同濃度ATO處理下的凋亡率比較 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)：未用ATO(0 μM)處理的對(duì)照組細(xì)胞和敲減組細(xì)胞，敲減組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(17.14%±1.50%vs.8.44%±0.40%,t=9.68,P=0.000 6)。15 μM ATO處理后，敲減組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(41.75%±2.98%vs.26.04%±0.76%,t=8.86,P=0.000 9)，見(jiàn)圖1。此外，蛋白免疫印跡檢測(cè)也證實(shí)ATO處理后,NEAT1敲減組KM3的促凋亡分子Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡分子Bcl-2表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖2。

圖1 NEAT1敲減組與對(duì)照組ATO誘導(dǎo)凋亡比較(n=3)

圖2 NEAT1敲減組與對(duì)照組ATO誘導(dǎo)凋亡蛋白表達(dá)比較(n=3)注：**與對(duì)照組比較，P<0.01

2.4 NEAT1敲減細(xì)胞株與對(duì)照株細(xì)胞Notch信號(hào)通路活化比較 未用ATO處理，我們發(fā)現(xiàn)敲減組細(xì)胞Notch信號(hào)通路較對(duì)照組減低。用15 μM ATO處理后，對(duì)照組Notch信號(hào)更為減低，且敲減組抑制顯著，見(jiàn)圖3。

圖3 NEAT1敲減組與對(duì)照組ATO抑制Notch信號(hào)通路比較(n=3)注：**與對(duì)照組比較，P<0.01

2.5 NEAT1調(diào)控Notch信號(hào)通路與ADAM10、PRKD2相關(guān) 利用qPCR檢測(cè)在對(duì)照組及敲減組中Notch1相關(guān)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，敲減組Notch1及Jag2表達(dá)下調(diào)，同時(shí)ADAM10及PRKD2表達(dá)顯著下調(diào)，見(jiàn)表3。

表3 NEAT1敲減組與對(duì)照組Notch相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)比較(n=3)

3 討論

砷在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中用于治療潰瘍、瘟疫及瘧疾等疾病已有上百年歷史[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，ATO被用于治療多種疾病如急性早幼粒細(xì)胞白血病、淋巴瘤、骨髓瘤及肝癌等。II/III期臨床研究表明，ATO聯(lián)合其他藥物可顯著提高多發(fā)性骨髓瘤療效，尤其對(duì)復(fù)發(fā)/難治性患者效果顯著[13-14]。本研究將骨髓瘤細(xì)胞與不同濃度ATO進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞對(duì)ATO敏感性不同，但在15 μM濃度處均出現(xiàn)明顯抑制效應(yīng)，抑制率為36.94%～73.91%，證實(shí)ATO對(duì)骨髓瘤細(xì)胞有抑制效應(yīng)。

ATO對(duì)骨髓瘤細(xì)胞具有抑制活性，已有研究顯示，ATO 可以抑制NF-kB、JAK/STAT3及Notch信號(hào)通路[15-17]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)ATO可抑制Notch信號(hào)通路成員Notch1和Jag2。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Notch在各實(shí)體腫瘤與血液腫瘤中參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性[18-20]，提示ATO對(duì)骨髓瘤細(xì)胞抑制作用依賴Notch信號(hào)通路。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。有報(bào)道，長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1可調(diào)控Notch信號(hào)通路[21-22]，并且NEAT1與腫瘤耐藥性有關(guān)。因此，推測(cè)ATO處理骨髓瘤細(xì)胞后可引起NEAT1表達(dá)變化，進(jìn)而導(dǎo)致Notch信號(hào)通路變化，發(fā)生耐藥表型。本研究發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細(xì)胞對(duì)ATO耐藥敏感性與NEAT1表達(dá)相關(guān)，并且ATO可抑制NEAT1表達(dá)，提示NEAT1是ATO重要作用靶點(diǎn)。后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NEAT1敲減細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞對(duì)ATO處理更為敏感，ATO抑制率大幅提高。流式細(xì)胞凋亡試驗(yàn)和蛋白免疫印跡檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，NEAT1敲減組較對(duì)照組誘導(dǎo)產(chǎn)生更多凋亡細(xì)胞，ATO處理后NEAT1敲減組凋亡率更進(jìn)一步提高，表明ATO介導(dǎo)NEAT1下調(diào)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起到關(guān)鍵作用。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),Notch信號(hào)通路可受ADAM10及PRKD2上游分子調(diào)控。有報(bào)道，ADAM10在乳腺癌中可以通過(guò)激活Notch信號(hào)通路，調(diào)節(jié)患者新輔助化療反應(yīng)和預(yù)后[19]。而在腸癌發(fā)生過(guò)程中，ADAM10異常表達(dá)，上調(diào)Notch信號(hào)通路[20]。在多發(fā)性骨髓瘤的研究中，ADAM10在癌癥微環(huán)境的炎癥和血管形成中起重要作用[21]。PRKD2是Notch信號(hào)通路的另一重要調(diào)節(jié)分子，在急性髓系白血病研究中，發(fā)現(xiàn)PRKD2可以通過(guò)上調(diào)Notch信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及化療藥物抵抗[22]。由此可見(jiàn)，ADAM10及PRKD2是Notch信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子。為進(jìn)一步解析NEAT1與Notch信號(hào)通路的關(guān)系，本研究也檢測(cè)了敲減組和對(duì)照組骨髓瘤細(xì)胞中Notch信號(hào)通路上游調(diào)節(jié)因子ADAM10及PRKD2基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，敲減組細(xì)胞ADAM10和PRKD2顯著下降，NEAT1可能通過(guò)上游調(diào)節(jié)因子作用于Notch信號(hào)通路，但需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn),ATO可通過(guò)NEAT1及Notch信號(hào)通路表達(dá)顯著抑制骨髓瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究為ATO臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為增強(qiáng)其療效提供精準(zhǔn)分子靶點(diǎn)。