孫玉潔，高敏政，朱藝文，鄭 良，俞丙然，徐福建

(北京化工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100029)

1 前 言

細(xì)菌感染是世界上威脅人類生命健康最為嚴(yán)重的問題之一，每年會導(dǎo)致數(shù)以百萬計(jì)的感染患者出現(xiàn)[1]。1928年英國微生物學(xué)家革命性地發(fā)現(xiàn)了世界上的第一種抗生素——青霉素，開啟了人類抗擊細(xì)菌感染的新紀(jì)元[2]，自此以后，抗生素的廣泛使用和開發(fā)解救了無數(shù)感染性疾病患者。然而，一方面，耐藥微生物越來越多地出現(xiàn)在臨床感染中，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為2019年全球十大健康威脅之一[3]。另一方面，相較于浮游狀態(tài)存在的細(xì)菌，生物膜的形式為細(xì)菌提供了堅(jiān)固的保護(hù)屏障[4, 5]。細(xì)菌可以定植在眾多的組織或器官表面形成生物膜，造成眼部感染、牙周炎、尿路感染和呼吸道感染等疾病[6, 7]，也可以附著在非生物材料表面，例如醫(yī)用導(dǎo)管、人工器官、骨植入材料等[8, 9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人類慢性微生物感染疾病的80%由生物膜造成，這導(dǎo)致了高的醫(yī)療保健成本以及高的發(fā)病率和死亡率[10, 11]，也為臨床使用的醫(yī)療器械消毒滅菌提出了更高的要求。生物膜的存在增加了臨床治療感染疾病的障礙，因?yàn)榕c浮游細(xì)胞相比，生物膜基質(zhì)中的細(xì)菌細(xì)胞的抗生素耐藥性高了1000倍[12]。生物膜和耐藥菌問題成為了全球治療細(xì)菌感染疾病中的兩大難題。

光動力抗菌療法(photodynamic antibacterial therapy, PDAT)是一種利用光敏劑(photosensitizers,PSs)在適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光源照射下產(chǎn)生短壽命但高毒性的活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species, ROS)，對周圍的生物分子(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等)造成氧化損傷，從而殺死病原微生物的方法。如圖1所示[2]，其作用主要由兩種分子水平的機(jī)制介導(dǎo)：I型和II型。光激活后，光敏劑分子從基態(tài)躍遷到短暫的單激發(fā)態(tài)，然后通過系間竄越到達(dá)三重激發(fā)態(tài)。三重激發(fā)態(tài)的光敏劑分子通過電子轉(zhuǎn)移直接與周圍的底物反應(yīng)產(chǎn)生自由基或自由基離子，如·OH和O2-(I型機(jī)制)。在PDAT中，I型反應(yīng)主要發(fā)生在細(xì)菌細(xì)胞膜上，磷脂分子與氧反應(yīng)形成脂質(zhì)過氧化物，細(xì)菌結(jié)構(gòu)完整性被破壞且細(xì)胞膜的離子滲透性增加。另一方面，三重激發(fā)的光敏劑分子還可以與氧傳遞能量以形成1O2。1O2作為最具威脅性的一類ROS，可直接對生物分子如不飽和脂質(zhì)、DNA、酶等細(xì)胞成分造成氧化損傷，從而有效殺滅細(xì)菌(II型機(jī)制)[13, 14]。光動力治療效果的影響因素主要包括以下幾點(diǎn)：① 光敏劑的影響和選擇：光敏劑是光動力治療的核心物質(zhì)，光敏劑能否選擇性地在病變組織部位聚集、能否快速地從正常組織中清除、對正常組織有無毒副作用、單線態(tài)氧量子產(chǎn)率等等，將直接影響光動力治療的實(shí)施和效果。② 激發(fā)光源的選擇：在PDAT的研究和臨床應(yīng)用中，主要采用激光作為激發(fā)光源。實(shí)驗(yàn)表明，波長越長的激發(fā)光源對組織的穿透越深，越有利于光動力治療。同時(shí)，激發(fā)光源的功率密度和能量密度既不能不足，又不得超過一定的范圍，不足會影響治療效果，過量會造成正常組織的損傷。③ 組織氧濃度的影響：氧是細(xì)胞賴以生存的物質(zhì)之一，組織中的氧濃度直接影響到PDAT的效果，在I型反應(yīng)中，光敏劑的三重態(tài)與底物發(fā)生電子轉(zhuǎn)移作用產(chǎn)生的自由基可進(jìn)一步與周圍的氧反應(yīng)生成氧化物；在II型反應(yīng)中，激發(fā)態(tài)的光敏劑分子在與基態(tài)氧分子碰撞的過程中發(fā)生能量的轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生單線態(tài)氧，光敏劑本身回到基態(tài)。所以，ROS的產(chǎn)生除與光敏劑和激發(fā)光有關(guān)外，還與組織中氧的濃度有關(guān)[15]。

圖1 光敏劑在光激發(fā)下產(chǎn)生活性氧物質(zhì)示意圖[2]

PDAT具有非侵入性、抗菌譜廣、在不易引發(fā)耐藥性的情況下可進(jìn)行重復(fù)治療、局部治療以保護(hù)重要器官等眾多優(yōu)勢[16]。在常規(guī)抗生素?zé)o法對抗耐藥細(xì)菌和生物膜感染的情況下，研究人員將視線集中在了PDAT上，它在對抗細(xì)菌感染中有望成為抗生素療法的替代方案[17, 18]。其中，光敏劑的開發(fā)是研究的重點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)高效的PDAT治療效果，光敏劑應(yīng)該滿足以下幾個(gè)要求：① 合成工藝簡單，成本低；② 水溶性好；③ 優(yōu)異的光穩(wěn)定性；④ 照射下產(chǎn)生大量ROS；⑤ 生理?xiàng)l件穩(wěn)定且對人體正常組織和器官無毒性[19]。除此以外，近年來，兩個(gè)關(guān)于光敏劑設(shè)計(jì)的主要問題逐漸為研究人員所關(guān)注：① 細(xì)菌靶向性，為了實(shí)現(xiàn)低毒且高效的治療效果，光敏劑被要求具有與細(xì)菌的強(qiáng)相互作用，而與細(xì)胞的親和力忽略不計(jì)；② 革蘭氏陰性細(xì)菌致密的外膜結(jié)構(gòu)成為阻礙光敏劑滲透的屏障[2, 20]，這使得PDAT對革蘭氏陽性細(xì)菌表現(xiàn)出有效的殺菌作用，而對革蘭氏陰性細(xì)菌的作用并不令人滿意。為了解決上述問題，研究者們開發(fā)了眾多細(xì)菌感染微環(huán)境響應(yīng)性或細(xì)菌靶向性光敏劑。本文聚焦于聚合物基光敏劑的設(shè)計(jì)與構(gòu)建，用于廣譜性、細(xì)菌靶向性和微環(huán)境響應(yīng)性PADT，實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌感染類疾病的高效治療。

2 廣譜性光動力抗菌高分子材料

PDAT最突出的特點(diǎn)表現(xiàn)在其抗菌譜廣，因?yàn)镽OS不需要特定的細(xì)菌靶標(biāo)便可發(fā)揮作用。然而，一方面，ROS的產(chǎn)量和作用距離有限，單一的光動力作用往往難以實(shí)現(xiàn)令人滿意的抗菌作用；另一方面，傳統(tǒng)光敏劑的疏水性通常會導(dǎo)致其在水性介質(zhì)中發(fā)生聚集而熒光淬滅，進(jìn)一步限制了ROS的產(chǎn)量，從而削弱其抗菌能力。為了解決這些問題，研究者們想到將傳統(tǒng)的光敏劑進(jìn)行化學(xué)改性以提高其水溶性，或?qū)DAT與其他方法結(jié)合，增強(qiáng)治療效果。

作者課題組[21]設(shè)計(jì)了一種新型陽離子PDAT聚合物，用于PDAT與季銨鹽(quaternary ammonium, QA)協(xié)同抗感染治療。如圖2a所示，利用開環(huán)反應(yīng)，基于光敏劑酸性紅87(EY)構(gòu)建的多功能抗菌聚陽離子(EY-QEGED-R，R=—C6H13或—CH3)具有包括QA、光敏劑、伯胺和羥基物質(zhì)在內(nèi)的多個(gè)功能成分。EY-QEGED-R在受貽貝啟發(fā)的聚多巴胺(polydopamine,PDA)粘合劑層的幫助下，可以被輕松地涂覆在不同的基材上。在體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中(圖2b和2c)，加光條件下，EY-QEGED-R對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性細(xì)菌)和大腸桿菌(革蘭氏陰性細(xì)菌)都表現(xiàn)出濃度依賴的抗菌活性，而在生物安全性的測試中，即使是在光照條件下，該陽離子聚合物的溶血性和細(xì)胞毒性都可忽略不計(jì)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對于大鼠表皮感染的治療效果也證明了EY-QEGED-R具有良好的抗感染能力(圖2d)。受到近些年新興的抗微生物水凝膠的啟發(fā)，Yuan等[22]構(gòu)建了一種基于水溶性聚噻吩(PMNT)和螺旋的仿生纖維聚異氰化物(PIC)的混合水凝膠，得到了增強(qiáng)的光動力抗菌治療效果。如圖3a所示，PIC與PMNT之間的相互作用和PIC的半柔性性質(zhì)使得PMNT的構(gòu)象發(fā)生變化，最大吸收峰從410紅移至600 nm。在紅光照射下，此水凝膠產(chǎn)生大量ROS，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽性細(xì)菌)和白色念珠菌(真菌)都表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌效果。另外，此水凝膠還表現(xiàn)出熱可逆性和生物相容性，為體內(nèi)應(yīng)用提供保障。類似地，Wang等[23]制備了酸性紅94/聚吡咯雜化聚乙烯醇水凝膠(RB/PPy PVA HD)，并在550 nm可見光和808 nm近紅外光的共同照射下，實(shí)現(xiàn)了光熱和PDAT的協(xié)同作用，可用作治療細(xì)菌感染的傷口敷料。除此之外，光動力抗菌高分子在醫(yī)療器械的表面修飾方面也得到了廣泛研究，如金屬-有機(jī)骨架(MOF)-聚合物混合基質(zhì)膜[24]、光敏劑與聚偏氟乙烯(PVDF)納米級纖維及微米級聚四氟乙烯(PTFE)顆粒組成的復(fù)合膜[25]、由檸檬酸-羥丙基-βCD聚合物(PP-CD)包裹卟啉類光敏劑TPPS修飾的聚丙烯(PP)織物形成的具有光動力抗菌作用的洗脫支架[26]等。Tong等[27]通過開環(huán)反應(yīng)連接了鋅(II)單氨基酞菁(ZnMAPc)與聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)，利用乙二胺(ED)清除多余的環(huán)氧基團(tuán)，并將此聚合物通過席夫堿鍵修飾到載玻片上。這一方法可以滅活革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌，這主要?dú)w因于光照條件下大量產(chǎn)生的ROS，例如·O2-和H2O2，從而引起的細(xì)菌膜的破壞、酶的失活和DNA的降解。上述幾篇報(bào)道都將光動力作用與生物材料表面相結(jié)合，為生物醫(yī)用材料提供抗菌性能，提高其使用安全性，降低二次感染的風(fēng)險(xiǎn)，使之具有用作抗感染傷口敷料或自消毒醫(yī)療器械的潛力。

圖2 PDAT與季銨鹽的協(xié)同抗菌作用[21]：(a)多功能陽離子聚合物的合成路線示意圖，(b)EY-QEGED-R對大腸桿菌(b1)和金黃色葡萄球菌(b2)的殺菌性能(比例尺：5 μm)，(c)EY-QEGED-R處理后的小鼠成纖細(xì)胞(L929)的細(xì)胞存活率(c1)和溶血率(c2)，(d)對大鼠表皮感染模型的治療效果(比例尺：1 cm)

圖3 PMNT與PIC構(gòu)建的混合水凝膠示意圖(a)[22];具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的TBD-anchor的結(jié)構(gòu)式和作用示意圖(b)，TBD-anchor與大腸桿菌的作用(c)[29];具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的光動力抗菌水凝膠的構(gòu)建及應(yīng)用示意圖(d)，F(xiàn)moc-F/BBR水凝膠對全層皮膚感染模型的治療(e)[30]

與傳統(tǒng)的光敏劑在聚集態(tài)時(shí)發(fā)生熒光淬滅和ROS產(chǎn)量下降相反，具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation induced emission,AIE)性質(zhì)的光敏劑表現(xiàn)出增強(qiáng)的熒光和持續(xù)產(chǎn)生ROS的能力[28]，逐漸吸引了研究者們的注意。例如，如圖3b所示，Chen等[29]設(shè)計(jì)的具有AIE性質(zhì)的膜錨定光敏劑(TBD-anchor)是一種具有多條季銨鹽鏈的共軛結(jié)構(gòu)物質(zhì)。圖3c表明，TBD-anchor通過靜電和疏水相互作用與細(xì)菌膜發(fā)生結(jié)合而不進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部。在白光照射下，隨著TBD-anchor濃度的增加，細(xì)菌的存活率顯著降低，5 μmol/L的TBD-anchor可殺死大約96%的大腸桿菌，2 μmol/L的TBD-anchor可殺死99.5%的金黃色葡萄球菌。相反，在黑暗環(huán)境中，高達(dá)40 μmol/L的TBD-anchor對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的毒性作用可忽略不計(jì)。對于耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)，TBD-anchor的光動力抗菌作用也超過了商業(yè)PS甲苯胺藍(lán)O。類似地，如圖3d所示，Xie等[30]將具有AIE性質(zhì)的光敏劑小檗堿氯化物(BBR)與一種商業(yè)氨基酸(Fmoc-F)結(jié)合，構(gòu)建光動力抗菌水凝膠。兩種物質(zhì)通過分子間靜電相互作用和π-π堆積進(jìn)行組裝，在白光照射下顯示出廣譜抗菌作用和抗生物膜活性。在小鼠背部的全層皮膚感染模型中，盡管Fmoc-F/BBR水凝膠能夠在黑暗條件下消除細(xì)菌感染，但其效率遠(yuǎn)低于光照治療組(圖3e)。Hao等[31]設(shè)計(jì)了麥芽七糖修飾的BODIPY(BODIPY-Mal-I)以提高光敏劑的水溶性，BODIPY核心的2,6位被碘取代后，單線態(tài)氧產(chǎn)生效率明顯提高。光照條件下，BODIPY-Mal-I可以有效殺死浮游形式和生物膜形成的革蘭氏陽性細(xì)菌，而在黑暗條件下，其對斑馬魚胚胎表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性。類似地，Hao等[32]替換光敏劑BODIPY為具有AIE性質(zhì)的四苯基乙烯，再與親水的麥芽七糖結(jié)合，可以得到具有熱響應(yīng)特性的兩親性分子。其在水性介質(zhì)中發(fā)生聚集，產(chǎn)生強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，該研究為構(gòu)建基于兩親性AIEgens的熒光溫度計(jì)提供了新的視角。

針對耐藥菌帶來的日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，Jiang等[33]的研究展示了一些可以充當(dāng)光敏劑的現(xiàn)有的抗生素，其在光照射下直接產(chǎn)生ROS以實(shí)現(xiàn)抗菌作用。他們找到了4種在光照條件下可以產(chǎn)生ROS的抗生素，并且利用耐卡那霉素的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，驗(yàn)證了它們的抗菌活性可以通過光激活得到明顯增強(qiáng)。雖然細(xì)菌對非致死劑量的抗生素會通過產(chǎn)生耐藥性進(jìn)行抵抗，但這種基于抗生素的PDAT可以擴(kuò)大現(xiàn)有抗生素的應(yīng)用范圍，降低其治療劑量，從而減緩耐藥性的出現(xiàn)。

綜上，臨床的細(xì)菌感染通常是由多種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性病原菌，甚至是耐藥性細(xì)菌引起[34]，PDAT的廣譜性可以滿足這一需求，同時(shí)避免引起新的耐藥性[35]。將PDAT與QA、水凝膠等結(jié)合，可以有效改善光敏劑的水溶性，提高利用效率；具有AIE性質(zhì)的光敏劑也巧妙地克服了傳統(tǒng)光敏劑聚集誘導(dǎo)淬滅的問題。這些研究為高分子材料用于光動力抗菌治療提出了新思路。

3 細(xì)菌靶向性光動力抗菌高分子材料

一些新型細(xì)菌靶向性光動力抗菌材料是通過增強(qiáng)材料對細(xì)菌的特異性識別作用進(jìn)而提高藥物的靶組織濃度，增強(qiáng)其在病灶部位的滲透率，從而提升藥物的生物利用度[36]，在實(shí)現(xiàn)高效抗菌的同時(shí)也減輕對正常組織的毒副作用，這些材料的設(shè)計(jì)為未來光動力抗菌材料的發(fā)展提供了新的思路。

在眾多的靶向分子中，天然糖類分子由于其良好的生物相容性和水溶性而常被用作構(gòu)建新型的靶向光動力抗菌材料。作者課題組[37]利用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合制備了一系列具有可控結(jié)構(gòu)和理想分子量的二嵌段共聚物PαGal50-b-PGRBn。如圖4a所示，其中的光敏劑酸性紅94(RB)鏈段在光照下可以產(chǎn)生ROS，進(jìn)而啟動抗菌活性，同時(shí)，α-D-半乳糖鏈段部分可以特異性結(jié)合銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)分泌的凝集素A(Lec A)，進(jìn)而達(dá)到靶向殺傷的作用。由于在P.aeruginosa的感染過程中，生物膜的形成部分由Lec A介導(dǎo)，因此在體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，PαGal50-b-PGRBn不僅體現(xiàn)了良好的抗菌性能，還能夠有效分散生物膜(圖4b～4d)。在評估PαGal50-b-PGRBn對正常小鼠成纖細(xì)胞(L929)的細(xì)胞毒性后發(fā)現(xiàn)，雖然在施加光照后細(xì)胞活力隨著PαGal50-b-PGRBn濃度的增加而降低，但仍顯示出相對良好的細(xì)胞活力。同時(shí)，在建立的多藥耐藥性P.aeruginosa生物膜感染性角膜炎模型中，PαGal50-b-PGRBn也表現(xiàn)出了良好的治療效果。

圖4 耐多藥細(xì)菌靶向納米系統(tǒng)及其在耐多藥銅綠假單胞菌生物膜感染兔角膜炎模型中的應(yīng)用[37]：(a)納米系統(tǒng)的構(gòu)建及其抗菌抗生物膜作用示意圖，(b)不同條件下納米系統(tǒng)對耐多藥銅綠假單胞菌的抗菌性能，(c)不同條件下納米系統(tǒng)的選擇性殺傷實(shí)驗(yàn)，(d)不同條件下納米系統(tǒng)對銅綠假單胞菌生物膜作用

Zhao等[38]構(gòu)建了一種基于硼二吡咯烯(BODIPY)的糖基化光敏劑。他們首先構(gòu)建了BODIPY基的RAFT試劑，然后通過RAFT聚合引入半乳糖鏈段，以此來構(gòu)建具有良好水溶性的糖基化光敏劑材料pGEMA-I。同樣利用其中半乳糖鏈段與P.aeruginosa分泌的Lec A特異性結(jié)合作用，該糖基化光敏劑材料能夠選擇性地附著在P.aeruginosa感染部位，在有效進(jìn)行光動力殺菌的同時(shí)減少了對正常組織的毒副作用。Im等[39]利用3′-唾液酸乳糖(3SL)對幽門螺桿菌的靶向作用，同時(shí)選用了脫鎂葉綠酸A(PPa)作為光敏劑，制備了3SL-聚賴氨酸基光動力抗菌材料(p3SLP)，該材料中的3SL結(jié)構(gòu)可以選擇性識別幽門螺桿菌膜中的唾液酸結(jié)合黏附素(SabA)成分并與其特異性結(jié)合，在激光照射下，光敏劑PPa釋放出ROS，從而達(dá)到了靶向光動力殺傷的效果。同時(shí)，在幽門螺桿菌感染的小鼠模型中，所構(gòu)建的p3SLP顯示出顯著的抗菌光動力效果，對正常組織和腸道菌群沒有不良副作用，為臨床中基于內(nèi)窺鏡的PDAT治療提供了一個(gè)可行的策略(圖5a和5b)。

細(xì)菌靶向肽是一種分布于動物和植物中的多肽類物質(zhì)，也是一種可變長度和氨基酸序列的短陽離子兩親性肽(一般含有10～50種氨基酸)。它通過靜電相互作用靶向并分解細(xì)菌細(xì)胞膜，誘導(dǎo)孔隙形成，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。而因其能夠特異性結(jié)合保持高電位梯度以及缺乏膽固醇的細(xì)菌膜而幾乎不影響正常細(xì)胞，近些年來也常被用于構(gòu)建靶向光動力抗菌材料[40-43]。例如，如圖5c所示，Gao等[44]構(gòu)建了親水聚乙二醇(PEG)和多肽Magainin-I的共價(jià)結(jié)合物，將其與光敏劑二氫卟吩e6(Ce6)和α-環(huán)糊精共聚物(α-CD-Ce6)進(jìn)行自組裝，進(jìn)而構(gòu)建了細(xì)菌膜靶向的超分子光敏劑載體。與不加多肽Magainin-I的α-CD-Ce6相比，通過激光共聚焦觀察到添加細(xì)菌靶向肽的組別對P.aeruginosa和MRSA都具有更好的生物膜消散能力(圖5d)，細(xì)胞毒性測試也進(jìn)一步證實(shí)了添加細(xì)菌靶向肽的組別具有更低的細(xì)胞毒性。蛋白質(zhì)是由多肽與其他物質(zhì)結(jié)合而成的一種大分子物質(zhì)，一些蛋白質(zhì)可以與細(xì)菌上特定的分子結(jié)合。革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞外膜上含有豐富的脂多糖(LPS)，LPS的表面多糖碳水化合物約占細(xì)菌表面積的75%，可被凝集素識別。刀豆蛋白A(ConA)是從菜豆中提取的一種應(yīng)用最為廣泛的凝集素，它可以與多糖的甘露糖基和葡糖基殘基特異結(jié)合，從而與細(xì)菌表面的LPS結(jié)合，目前已經(jīng)被用于對大腸桿菌的特異性識別當(dāng)中[45-47]。Cantelli等[48]利用ConA的這一特性，將其與光敏劑RB結(jié)合，制備了ConA-RB共聚物。由于RB對革蘭氏陽性細(xì)菌具有高活性，而對革蘭氏陰性細(xì)菌的活性較低，因此，該共聚物增加了RB在革蘭氏陰性細(xì)菌表面的局部濃度，顯著提高了它對革蘭氏陰性細(xì)菌的殺滅效率，體外抗菌實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了該共聚物對于大腸桿菌具有良好的抗菌效果(圖6a和6b)。

圖5 3′-唾液酸乳糖共軛聚賴氨酸基光敏劑(p3SLP)抗幽門螺桿菌靶向光動力治療作用示意圖(a)，使用激光共聚焦觀察p3SLP的抗幽門螺桿菌靶向光動力治療性能(b)[39];α-CD-Ce6/PEG-AMP超分子膠束示意圖示意圖(c)，α-CD-Ce6/PEG-AMP超分子膠束對P.aeruginosa、MRSA兩種細(xì)菌生物膜的消除作用(d)[44]

除了利用天然糖類分子以及多肽物質(zhì)與細(xì)菌的特異性結(jié)合作用來構(gòu)建靶向光動力抗菌材料外，近些年來，利用革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌自身結(jié)構(gòu)的不同，也有新型的靶向光動力材料被構(gòu)建出來[49]。例如Lee等[35]利用革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)上的不同，構(gòu)建了具有AIE特性的近紅外光敏劑(TTVP)。如圖6c和6d，革蘭氏陰性細(xì)菌的外層由外膜、交聯(lián)肽聚糖網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞質(zhì)膜組成，比只有肽聚糖網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞質(zhì)膜的革蘭氏陽性細(xì)菌的外層要復(fù)雜得多，因此革蘭氏陽性細(xì)菌缺乏有效的屏障來阻止TTVP分子的插入，從而使得TTVP分子只能夠與革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)菌膜特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了對陽性菌的靶向識別。TTVP分子在培養(yǎng)基中具有良好的單分散性、與革蘭氏陽性細(xì)菌的強(qiáng)靜電相互作用以及優(yōu)異的AIE特性，也具有較高的ROS產(chǎn)率，在體內(nèi)和體外抗菌實(shí)驗(yàn)中都取得了良好的抗菌效果，為臨床應(yīng)用中設(shè)計(jì)細(xì)菌鑒別劑提供了有效的策略。

圖6 抗革蘭氏陰性細(xì)菌的ConA-RB光動力抗菌原理示意圖(a)，ConA-RB分子的合成示意圖(b1)和對E.coli的光動力抗菌效果(b2)(b)[48];使用AIE分子TTVP進(jìn)行革蘭氏陽性細(xì)菌超快鑒別和高效光動力抗菌治療的示意圖(c)，激光共聚焦觀察TTVP分子與陽性菌的特異性結(jié)合(d)[35]

綜上所述，新型靶向光動力材料在實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌靶向性的同時(shí)增加了材料在細(xì)菌感染部位的富集，與傳統(tǒng)光動力抗菌材料相比，靶向光動力抗菌材料提升了材料的利用率和光動力抗菌治療的效果，同時(shí)也減少了對正常組織細(xì)胞的毒副作用，是未來新型光動力抗菌材料一個(gè)可行的發(fā)展方向。

4 微環(huán)境響應(yīng)性光動力抗菌高分子材料

細(xì)菌或生物膜感染獨(dú)特的微環(huán)境(如pH、毒素、酶等)啟發(fā)了科研人員對響應(yīng)性抗菌材料的設(shè)計(jì)。為了使抗菌劑具有更強(qiáng)的靶向細(xì)菌或滲透生物膜的能力，大量感染微環(huán)境響應(yīng)的清除細(xì)菌或生物膜的系統(tǒng)已經(jīng)被開發(fā)[50-52]。其中，細(xì)菌感染部位的pH值降低主要是由細(xì)菌的代謝產(chǎn)物造成的，其產(chǎn)物是包括乳酸和乙酸在內(nèi)的有機(jī)酸[53-55]，該現(xiàn)象已被廣泛用作細(xì)菌感染的標(biāo)志。已經(jīng)有眾多針對細(xì)菌微酸性環(huán)境設(shè)計(jì)聚合物基抗菌材料的報(bào)道，例如，Hu等[56]設(shè)計(jì)了一種席夫堿鍵連接的聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(PAMAM)水凝膠，在酸性環(huán)境下，奧硝唑和妥布霉素實(shí)現(xiàn)了有效釋放；Yan等[57]構(gòu)建了一個(gè)pH響應(yīng)性分層聚合物刷，在正常生理?xiàng)l件下，聚甲基丙烯酸(PMAA)外層的存在顯著抑制了細(xì)菌的黏附，當(dāng)局部環(huán)境變?yōu)樗嵝詴r(shí)，PMAA鏈斷裂，暴露出內(nèi)部的陽離子抗菌肽，激活殺菌功能；Qian等[58]開發(fā)的乙二醇-殼聚糖共軛羧基石墨烯(GCS-CG)對膿腫的酸性微環(huán)境表現(xiàn)出獨(dú)特的自適應(yīng)性，表面電荷由負(fù)轉(zhuǎn)變?yōu)檎?，對?xì)菌產(chǎn)生強(qiáng)的黏附性，再由近紅外光(NIR)輻射下產(chǎn)生的升溫作用消滅細(xì)菌。而在聚合物基PDAT領(lǐng)域，研究人員也充分利用細(xì)菌感染微環(huán)境的特征，構(gòu)建了響應(yīng)性的光敏劑，其在正常生理環(huán)境下幾乎不產(chǎn)生毒性作用，而在細(xì)菌感染部位，受到光的激發(fā)后，會產(chǎn)生殺傷性的ROS，發(fā)揮預(yù)期的光動力抗菌作用。

Liu等[59]通過RAFT聚合和后修飾合成了可自組裝成核殼結(jié)構(gòu)的聚(聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)-b-聚(2-(二異丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯-2-羥乙基甲基丙烯酸酯)-二氫卟酚(PPEGMA-b-P(DPA-co-HEMA)-Ce6)，當(dāng)其被靜脈注射到血液中時(shí)，在循環(huán)過程中對正常組織表現(xiàn)出的相互作用和毒性可忽略不計(jì)。而在酸性條件下，由于DPA的質(zhì)子化，P(DPA-co-HEMA)-Ce6鏈段有效促進(jìn)了細(xì)菌的靶向作用和陽離子治療，光敏劑Ce6在光照作用下也可以用于成像，并產(chǎn)生具有抗菌作用的ROS。革蘭氏陰性細(xì)菌的致密外膜阻礙了其與光敏劑的有效結(jié)合，使得PDAT的殺菌效率有限。如圖7a所示，作者課題組[60]的研究中，光敏劑RB與PDA共價(jià)結(jié)合形成納米顆粒核心，隨后，外層修飾多粘菌素B(PMB)提高了納米顆粒對革蘭氏陰性細(xì)菌的殺菌作用，最后，通過靜電作用在納米顆粒最外層修飾負(fù)電性的葡萄糖酸(GA)得到納米復(fù)合物RB@PMB@GA。此復(fù)合物在生理?xiàng)l件下表現(xiàn)出負(fù)電性，對正常細(xì)胞的毒性較小，在酸性相關(guān)感染部位切換為帶正電荷，能夠有效結(jié)合到帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面，從而增強(qiáng)了對革蘭氏陰性細(xì)菌的光動力抗菌作用。如圖7b和7c所示，在酸性條件下RB@PMB@GA對革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌都具有優(yōu)異的殺菌作用，且具有比對照組更強(qiáng)的生物膜滲透能力。在體內(nèi)導(dǎo)管植入構(gòu)建的膿腫模型中，納米復(fù)合物同樣表現(xiàn)出優(yōu)異的抗感染效果(圖7d)，為臨床手術(shù)中醫(yī)療器械表面生物膜的消除提供了可行的方案。

圖7 用于PDAT的pH響應(yīng)性納米系統(tǒng)[60]：(a)納米顆粒的構(gòu)建及抗菌作用示意圖，(b)不同治療條件下納米顆粒對表達(dá)紅色蛋白的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能，(c)不同pH下納米顆粒對銅綠假單胞菌生物膜作用的CLSM照片，(d)不同治療條件下大鼠的切口區(qū)域和植入導(dǎo)管圖片(d1)以及菌落情況(d2)

除了pH值變化外，高水平的過氧化氫(H2O2)是感染病理微環(huán)境的另一個(gè)顯著特征，常被用來觸發(fā)藥物的響應(yīng)性釋放。受這一特性的啟發(fā)，Zhao等[61]構(gòu)建了一個(gè)pH/H2O2雙觸發(fā)的光動力抗菌系統(tǒng)。如圖8a所示，在這個(gè)系統(tǒng)中，5,10,15,20-四-{4-[3-(N,N-二甲基-氨基)丙氧基]苯基}卟啉(TAPP)充當(dāng)pH敏感的光敏劑，由H2O2響應(yīng)性的嵌段共聚物POEGMA-b-PBMA進(jìn)行封裝，其上的苯硼酸酯部分在中性和弱酸條件下穩(wěn)定，但對H2O2敏感。在細(xì)菌引起的膿腫病灶部位(圖8b)，pH值降低且H2O2過量，光敏劑TAPP被釋放，其上的叔胺基團(tuán)可以在酸性條件下發(fā)生質(zhì)子化作用，提高親水性和與細(xì)菌的相互作用，大大提高了PDAT的治療效果。與之相似，Hu等[62]的設(shè)計(jì)充分利用了生物膜感染微環(huán)境的酸性和過表達(dá)谷胱甘肽(GSH)的特點(diǎn)。如圖8c所示，他們利用主客體組裝作用將前藥α-CD-NO和α-CD-Ce6與pH敏感的共聚物PEG-(KLAKLAK)2-DA進(jìn)行組裝，此納米組裝體在生理pH環(huán)境下具有帶負(fù)電荷的表面，有利于在血液中長期循環(huán)，而在酸性生物膜pH下，α-CD-Ce6-NO-DA納米藥物表現(xiàn)出正電，促進(jìn)生物膜內(nèi)部的有效滲透并黏附到帶負(fù)電的細(xì)菌表面(圖8d)。隨后，受到GSH的觸發(fā)，α-CD-Ce6-NO-DA釋放出NO，一方面降低了生物膜中GSH的濃度；另一方面，NO與光輻射下產(chǎn)生的ROS反應(yīng)生成活性氮物質(zhì)(reactive nitrogen species,RNS)，表現(xiàn)出對細(xì)菌更強(qiáng)的損傷作用(圖8e)。他們構(gòu)建的表面電荷可切換的α-CD-Ce6-NO-DA納米顆粒對MRSA生物膜感染表現(xiàn)出NO協(xié)同的光動力抗菌作用。類似地，對P.aeruginosa引起的角膜炎，Han等[63]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，例如MMP-9，在細(xì)菌生物膜中過度表達(dá)，并在角膜融化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。利用這一特性，他們將Ce6偶聯(lián)的β-環(huán)糊精前藥(β-CD-Ce6)和金剛烷綴合的MMP-9敏感肽(Ad-MMP-S PEPs)進(jìn)行主客體組裝，得到具有親水外殼和疏水內(nèi)核的組裝體(MMP-S)(圖9a)。正常生理環(huán)境下，多肽外殼表面帶負(fù)電，可以減小對正常組織的損傷。到達(dá)角膜感染部位后，生物膜中過度表達(dá)的MMP-9切斷肽鏈，去除負(fù)電保護(hù)層，暴露出陽離子多肽，有助于納米顆粒滲透進(jìn)入生物膜內(nèi)部(圖9b)，并與P.aeruginosa結(jié)合，最終提高PDT的抗菌功效。在P.aeruginosa感染的角膜炎模型中，MMP-S+L組的抗菌效果最好(圖9c)，與抗生素左氧氟沙星效果相當(dāng)，但后者有引起細(xì)菌耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。加光條件下，此納米組裝體在體內(nèi)也表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能，這是系統(tǒng)內(nèi)光敏劑和響應(yīng)性陽離子肽共同作用的結(jié)果。由此制成的局部滴眼制劑可以很大程度上抑制細(xì)菌對角膜組織的進(jìn)一步損害，降低角膜炎癥反應(yīng)。

圖8 pH/H2O2雙觸發(fā)的光動力抗菌系統(tǒng)示意圖(a)，體內(nèi)導(dǎo)管植入模型中聚合物的抗生物膜活性(b)[61]；α-CD-Ce6-NO-DA納米顆粒的構(gòu)建(c1)、酸觸發(fā)的電荷反轉(zhuǎn)(c2)和pH和GSH雙響應(yīng)的納米組裝體消除生物膜感染(c3)示意圖(c)，納米組裝體對MRSA生物膜的滲透能力(d)，納米組裝體對MRSA生物膜的殺傷作用(e)[62]

圖9 MMP-9響應(yīng)性組裝體的構(gòu)建和消除角膜感染示意圖(a)，MMP-S對P.aeruginosa生物膜的滲透能力(b)，角膜組織處細(xì)菌菌落照片(c)[63]；pH和耐藥性響應(yīng)的組裝體的合成路線(d1)和可變色創(chuàng)可貼對pH和耐藥性的響應(yīng)作用(d2)示意圖(d),可變色創(chuàng)可貼對藥物敏感性細(xì)菌(e)和耐藥性大腸肝菌(f)的抗菌作用，pH和β-內(nèi)酰胺酶響應(yīng)的可變色創(chuàng)可貼的作用機(jī)制示意圖(g)[64]

PDAT作為一種廣譜性殺傷細(xì)菌的新型抗菌方法，在對抗耐藥菌感染中具有天然優(yōu)勢。除卻普通細(xì)菌感染微環(huán)境的眾多特性外，對β-內(nèi)酰胺類抗生素不敏感的細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶也被視為耐藥菌特定的識別信號。Sun等[64]設(shè)計(jì)了一種對細(xì)菌微酸性環(huán)境和耐藥性響應(yīng)性的纖維素基可變色創(chuàng)可貼。當(dāng)此創(chuàng)可貼與敏感性細(xì)菌共同培養(yǎng)時(shí)，降低的pH使顯色層溴百里酚藍(lán)的顏色從綠色變?yōu)辄S色，同時(shí)，被殼聚糖包裹的抗生素氨芐青霉素被釋放，產(chǎn)生殺菌作用。另一方面，當(dāng)其暴露在耐藥性細(xì)菌環(huán)境中時(shí)，頭孢硝噻吩作為β-內(nèi)酰胺酶的底物，產(chǎn)生從黃色到紅色的顏色變化。此時(shí)，基于光敏劑四(4-羧基苯基)-卟啉(TCPP)形成的MOF納米粒子在光照條件下產(chǎn)生ROS，實(shí)現(xiàn)對耐藥菌有效的光動力殺傷(圖9d)。此可視化創(chuàng)可貼實(shí)現(xiàn)了在感測細(xì)菌耐藥性后選擇性地實(shí)施抗菌策略，即面對敏感性細(xì)菌時(shí)，采取基于抗生素的化學(xué)療法，而對于耐藥細(xì)菌誘導(dǎo)的感染，利用光動力作用進(jìn)行補(bǔ)充(圖9e～9g)。

與普通PDAT相比，基于高分子材料的微環(huán)境響應(yīng)性光敏劑可以實(shí)現(xiàn)在感染部位的按需釋放或激活，增強(qiáng)對細(xì)菌的靶向性和對生物膜的滲透作用，提高了材料的生物利用度，同時(shí)降低了抗菌藥物或ROS對正常組織的毒副作用。

5 結(jié) 語

綜上所述，針對細(xì)菌感染性疾病構(gòu)建多功能高分子光敏劑的策略已經(jīng)被眾多研究者關(guān)注，具有良好的發(fā)展前景。常規(guī)的光動力抗菌療法(photodynamic antibacterial therapy, PDAT)由于其廣譜殺菌行為有望符合臨床需求而被大量研究，細(xì)菌靶向性或微環(huán)境響應(yīng)性的高分子光敏劑實(shí)現(xiàn)了材料的高效利用和更好的生物安全性。這些可行方案都為細(xì)菌感染性疾病的治療提供了新思路。

然而，雖然研究人員已經(jīng)對高分子材料的PDAT進(jìn)行了大量研究，但仍存在一些障礙限制著這些材料的臨床轉(zhuǎn)化，如光敏劑(PSs)的跨膜能力和在細(xì)菌內(nèi)的有效積累量直接影響PDAT作用效果、活性氧物質(zhì)(ROS)的短壽命對它們的ROS產(chǎn)率提出更高要求等。另外，現(xiàn)有的PDAT研究主要集中在皮膚、角膜感染等表層感染疾病，受到光照穿透深度的限制，PDAT難以用于肺炎、肝炎等深層次疾病。并且，病灶部位低于正常部位的氧氣濃度也是限制PDAT效果的因素之一。這些問題還需要尋找更多的方案來解決。此外，要推動高分子光敏劑的臨床轉(zhuǎn)化，需要對其體內(nèi)毒性、生物分布、體內(nèi)清除等進(jìn)行系統(tǒng)評估，這些也有待進(jìn)一步研究?？傮w而言，高分子材料在光動力抗菌領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得了初步成果，相信面臨的大部分問題都可以通過后續(xù)的探索來解決，高分子抗菌材料將在臨床光動力抗菌治療中發(fā)揮越來越重要的作用。