王軍鵬 呂品品 劉 磊 濟(jì)源市疾病預(yù)防控制中心（河南，濟(jì)源，459000）

張廣偉 河南省疾病預(yù)防控制中心（河南，鄭州，450018）

致瀉大腸埃希菌（diarrheagenic Escherichia coli，DEC）引起腸道感染致腹瀉，與食入污染的食品和飲水有關(guān)，為外源性感染［1］。根據(jù)其致病機(jī)制不同，引起胃腸炎的DEC 分為5 種類型，即腸產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（enterotoxigenic E.coli，ETEC），腸侵襲性大腸埃希菌（enteroinvasive E.coli，EIEC），腸致病性大腸埃希 菌 （enteropathogenic E.coli，EPEC），腸出血性大腸埃希菌 （enterohemorrhagic E.coli，EHEC）和腸聚集性大腸埃希菌 （eneteroaggregative E.coli，EAEC）?？焖贆z測和鑒定病原菌是及時(shí)有效地控制與預(yù)防傳染病傳播的重要手段。DEC 的傳統(tǒng)檢測方法是分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)分型，該方法的缺陷是實(shí)驗(yàn)周期長，對DEC 尤其是生化非典型的菌株進(jìn)行細(xì)菌鑒定時(shí)誤檢率和漏檢率較高［2-3］。分子生物學(xué)方法以其檢測速度快、敏感度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為對病原菌快速鑒別與分型的重要技術(shù)之一，能準(zhǔn)確檢測出病原菌攜帶的毒力基因。多重PCR（multiplex PCR，mPCR）又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在同一體系里加上2 對或2 對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核苷酸片段的PCR 反應(yīng)，一次反應(yīng)可檢出多種不同的毒力基因，因而擴(kuò)大了檢測范圍并提高了檢測速度［4］，且重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)。PFGE 分型技術(shù)和多重PCR 檢測可作為DEC 引起的食源性疾病診斷的參考依據(jù)。本分析呈現(xiàn)該事件實(shí)驗(yàn)室檢測過程并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

1 內(nèi)容和方法

1.1 內(nèi)容

1.1.1 病例定義

2020 年8 月20 日，濟(jì)源市某酒店發(fā)生一起聚集性食源性疾病。中午參加婚宴共同進(jìn)餐人數(shù)315人，截至21 日中午發(fā)病住院患者79 例。臨床表現(xiàn)為首先出現(xiàn)輕微腹痛，相繼發(fā)生惡心、腹瀉等癥狀，嘔吐癥狀較輕，腹瀉一般3～10 次，多為水樣便，并伴不同程度的低熱（≤38.5 ℃）。全部患者1～3 d 痊愈，沒有死亡病例出現(xiàn)。

1.1.2 樣本采集

開展現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查的同時(shí)，采集酒店中婚宴當(dāng)天剩余的可疑食物及住院患者的腹瀉物、肛拭子等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測。采集菜品樣品9 份（五香牛肉、大刀耳片、肘子、西芹桃仁、梅菜扣肉、烤雞、千葉豆腐、紅豆沙、熟鵪鶉蛋各1 份），砧板1 個(gè)，腹瀉物10 份，肛拭子2 份，共計(jì)22 份樣本，緊急送至濟(jì)源市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行檢測。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑

培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司和北京路橋技術(shù)股份有限公司，NID 鑒定卡購于美國BD公司，核酸提取試劑盒購于西安天隆科技有限公司，5 種致DEC 核酸多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測試劑盒購于北京卓誠惠生生物科技股份有限公司，內(nèi)切酶Xba I 購于日本TaKaRa 公司，標(biāo)準(zhǔn)菌株購于廣東環(huán)凱生物有限公司。

1.1.4 檢測儀器

蘇靜安泰BSC-1304II A2 型生物安全柜、北京光明SPX-150 型生化培養(yǎng)箱、BD PhoenixTM100 全自動(dòng)微生物鑒定儀、西安天隆NP968 核酸提取儀、ABI QuantStudioTM7 Flex 熒光PCR 儀，BIO-RAD 脈沖場凝膠電泳儀等。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查

結(jié)合現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查，按照GB 4789.7—2013 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》、GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》、GB 4789.10—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃葡萄球菌檢驗(yàn)》、GB 4789.6—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》等標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行致病菌分離及培養(yǎng)。

1.2.2 致病菌的分離與初步鑒定

將分離的可疑純菌株用NID 鑒定卡經(jīng)BD PhoenixTM100 全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行初步生化鑒定，鑒定結(jié)果為大腸埃希菌。

1.2.3 細(xì)菌核酸提取

使用1 μL 接種環(huán)刮取營養(yǎng)瓊脂平板上經(jīng)BD PhoenixTM100 全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定的可疑菌落，懸浮于200 μL 滅菌雙蒸水中，充分打散制成濃度108～109CFU/mL 的菌懸液備用。按照西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌核酸提取試劑盒說明書要求，用NP968 全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行核酸提取。取2 μL 核酸提取液做為模板。

1.2.4 5 種DEC 核酸多重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法的建立

北京卓誠惠生生物科技股份有限公司出品的5種DEC 多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測試劑盒同樣采用多重PCR 技術(shù)。對同一樣本采用A、B、C 三種PCR 反應(yīng) 體 系 對5 種DEC （EPEC、EHEC/STEC、ETEC、EIEC、EAEC）進(jìn)行檢測。A 管可用于EPEC 和EHEC/STEC 的檢測，B 管可用于ETEC 和EIEC 的檢測，C 管可用于EAEC 和大腸埃希菌種屬的鑒定。通過收集PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號，確定待測樣本是否含大腸埃希氏菌的同時(shí)，判定其致病型別。

將多重PCR 反應(yīng)條件設(shè)定為：預(yù)變性95 ℃5 min，1 個(gè)循環(huán)；變性95 ℃15 s，退火/延伸60 ℃60 s，40 個(gè)循環(huán)?！癛eporter Dye”分別設(shè)置為FAM、VIC、CY5 和ROX?！癚uencher Dye”均為None。致病型別的判定標(biāo)準(zhǔn)如表1 所示。

表1 5 種DEC 毒力基因及型別判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 脈沖場凝膠電泳（PFGE）

依照《食源性疾病PFGE 分子溯源標(biāo)準(zhǔn)操作程序》，對多重?zé)晒釶CR 檢測陽性的DEC 進(jìn)行PFGE檢測。采用沙門菌Braenderup 血清型H9812 菌株為標(biāo)準(zhǔn)菌株，Xba I 酶切，作為Marker。BioNumerics 軟件對PFGE 圖譜進(jìn)行聚類分析。不同基因型的判斷按照菌種間相似性系數(shù)作為同一譜型劃分依據(jù)［5］，按圖譜相識系數(shù)≥85%表現(xiàn)為克隆關(guān)系的菌株，＜85%表現(xiàn)為無克隆關(guān)系［6］。

2 結(jié)果及分析

2.1 致病菌檢測

采集病例腹瀉物10 份、肛拭子2 份、剩余菜品等10 份，共計(jì)22 份樣本中有5 份樣本分離出菌株，經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀器和多重?zé)晒釶CR 檢測，結(jié)果提示為DEC 陽性。其他致病菌均未檢出。

2.2 毒力基因檢測

從2 份菜品（五香牛肉、大刀耳片）和3 份病例腹瀉物共計(jì)5 份樣本中分離鑒定出EAEC 菌株18株，其毒力基因均為uidA（+）aggR（+）astA（+）pic（+），占100.0%。ETEC、EIEC、EPEC 和EHEC 均未檢出。

2.3 脈沖場凝膠電泳（PFGE）

PFGE 主要用于傳染病的流行病學(xué)研究及細(xì)菌分子分型，疾病預(yù)防控制中心利用PFGE 驗(yàn)證傳染病的暴發(fā)流行，追溯傳染源及傳播途徑［7］。此次食源性疾病分離到的18 株EAEC 菌經(jīng)PFGE 檢測，采用BioNumerics 軟件聚類分析。結(jié)果提示，食品、腹瀉物樣本分離的18 株菌株為同一PFGE 型別，同源性為100.0%。

3 討論與分析

依據(jù)現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查資料和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，可以確診此次突發(fā)事件是因患者食用了粘附性大腸埃希菌（EAEC）污染的肉類涼菜而引起的食源性疾病。DEC 中的EAEC 感染后臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，呈持續(xù)性水樣腹瀉，伴脫水，偶有血便［8］，低熱，通常無腹痛，很少有嘔吐，符合此次突發(fā)事件的臨床特征。EAEC 所致人體感染與宿主易感性、宿主免疫反應(yīng)、菌株毒力異質(zhì)性以及感染者所攝入的菌量有關(guān)［9］。

建國以來，在我國的食源性疾病暴發(fā)事件中，致病原因不明的急性胃腸炎占20%左右［10-12］，且癥狀相似，病因多樣。DEC 引起的食源性疾病鮮有報(bào)道，經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌檢測用培養(yǎng)法，雖然可靠但耗時(shí)長［13］，而且不能有效地區(qū)分DEC 和非DEC，檢驗(yàn)結(jié)果并不能作為是否有致病能力的依據(jù)，只能說某個(gè)血清型可能與致病相關(guān)。因此在傳統(tǒng)檢測方法的基礎(chǔ)上，有必要進(jìn)行大腸埃希菌的毒力基因檢測。多重?zé)晒釶CR 檢測具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、效率高和成本低等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測。本次事件中，通過構(gòu)建多重檢測體系不僅可以確定可疑菌株是否為大腸埃希菌，還能判定其致病性，為DEC 的監(jiān)控、檢測及溯源等提供了參考依據(jù)。

PFGE 具有技術(shù)成本小、技術(shù)門檻低、可重復(fù)性高和實(shí)驗(yàn)室間比對性好等特點(diǎn)，在各類突發(fā)公共衛(wèi)生事件（例如院內(nèi)感染、食源性疾病暴發(fā)和細(xì)菌學(xué)傳染病暴發(fā)）中得到廣泛應(yīng)用，成為目前細(xì)菌流行病學(xué)溯源研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”［14］。本事件用PFGE 分型技術(shù)對分離的可疑DEC 進(jìn)行分子分型與聚類分析，提示其同源性為100.0%。根據(jù)Tenover 等［5］的原則判定，從所采剩余涼菜和患者腹瀉物中分離的菌株為同一PFGE 型。

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，致病菌溯源已進(jìn)入生物信息時(shí)代，食源性致病菌的鑒定及事件溯源更多地通過基因型別、分子型別或全基因組測序方式獲得更精準(zhǔn)的結(jié)果［15］。在食源性疾病的溯源分析中，可結(jié)合多重PCR 技術(shù)和PFGE 分型技術(shù)，綜合作為實(shí)驗(yàn)室確診的參考判定依據(jù)，對事件的分析及判定更有意義，更能提高不明原因食源性疾病的診斷率，真正發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室檢測的技術(shù)支撐作用。