辛超 張權(quán)武

(陜西省結(jié)核病防治院，陜西 西安 710100)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染性疾病，任何年齡段均可發(fā)病，免疫力低下者更容易感染，其主要的轉(zhuǎn)播途徑為飛沫傳播[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示[2]，結(jié)核病患者中，有大約10%的患者會發(fā)展為活動性疾病。既往研究表明[3]，若結(jié)核分枝桿菌受到感染，中性粒細(xì)胞會通過血液向受感染部位遷移，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生變化，可作為急性炎癥的標(biāo)志。隨著臨床對結(jié)核病研究的不斷深入，有學(xué)者[4]認(rèn)為多形核細(xì)胞家族受細(xì)胞因子吸引的免疫反應(yīng)，可能與抗結(jié)核病細(xì)菌感染有一定的關(guān)系，可以防御早期感染。TOLL樣受體(TLRs)在巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞(前體細(xì)胞)等細(xì)胞上有所表達(dá)，若皮膚、腸道黏膜等受到感染，TLRs會對其進(jìn)行識別，以此對免疫反應(yīng)進(jìn)行啟動[5]。目前，臨床關(guān)于結(jié)核病感染期間，中性粒細(xì)胞CD64、TLR2、TLR4表達(dá)的變化及其對免疫反應(yīng)的研究并不多見。本研究主要探討結(jié)核病患者中性粒細(xì)胞CD3、CD4、CD8、CD64和TLR2、TLR4、CRP表達(dá)及其意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年6月至2021年6月我院收治的結(jié)核病患者，健康體檢者，肺部良性疾病患者、肺部惡性腫瘤各50例患者作為研究對象。結(jié)核病患(進(jìn)展期18例、好轉(zhuǎn)期16例、穩(wěn)定期16例)者：男27例，女23例；年齡31～83歲，平均年齡(61.59±11.03)歲。健康體檢者：男25例，女25例；年齡28～81歲，平均年齡(62.03±11.14)歲。肺部良性疾病者：男29例，女21例；年齡26～85歲，平均年齡(61.16±11.01)歲。肺部惡性腫瘤患者：男31例，女19例；年齡32～87歲，平均年齡(61.83±11.08)歲。納入患者均符合結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；精神和認(rèn)知正常，意識清晰；依從性較佳，可積極配合完成相關(guān)檢測及調(diào)查工作；臨床資料完整、齊全。已排除合并嚴(yán)重心肝腎等器質(zhì)性病變者；伴有其他傳染性疾病者；艾滋病毒/艾滋病、高血壓疾病史；妊娠期或哺乳期者；合并惡性腫瘤疾病者。各組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法 于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，經(jīng)靜脈穿刺采集受試者的肝素化血液3 mL，保存至EDTA抗凝管中，及時(shí)送檢。要求采集標(biāo)本時(shí)，嚴(yán)格堅(jiān)持無菌操作的原則，確保標(biāo)本無污染。對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行接種處理，所接種的培養(yǎng)基為酸性羅氏培養(yǎng)基。接種時(shí)，斜面朝上，培養(yǎng)箱的溫度為恒溫37℃，每隔3 d進(jìn)行1次觀察。若長出菌落，轉(zhuǎn)接至MGIT960液體培養(yǎng)基中，A600達(dá)到0.8后待用。

1.3指標(biāo)檢測 使用PBS溶液對細(xì)胞進(jìn)行洗滌2次，行流式細(xì)胞術(shù)染色方案。對于中性粒細(xì)胞Fcy受體CD3、CD4、CD8和CD64的表達(dá)的檢測。選取肝素化血液各30μL，分別代表兩組。將TLR2-PE、TLR4-PE單克隆抗體分別加入其中，進(jìn)行為期0.5 h的孵育。隨后采用PBS洗滌液進(jìn)行1清洗，3 000 r/min離心環(huán)境下離心處理10 min，將上層血清分離，保存并作為感染前待測樣本。加入抗體前，加入結(jié)核分枝桿菌液30 μL，在37℃的情況下，進(jìn)行0.5 h的孵育。加入TLR2-PE、TLR4-PE單克隆抗體，并重復(fù)上述操作，獲得結(jié)核分枝桿菌感染后待測液。采用QT-PCR法，對中性粒細(xì)胞TLR2、TLR4進(jìn)行檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELIA)對CRP進(jìn)行檢測，使用全自動生化分析儀(日立SF3600)操作，試劑盒購自上海物聯(lián)生物科技有限公司，檢測時(shí)嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明操作，確保檢測的質(zhì)量。

2 結(jié) 果

2.1外周血中性粒細(xì)胞水平 結(jié)核病患者的CD3、CD4、CD8均低于健康體檢者和肺部良性疾病患者，高于肺部惡性腫瘤患者，但CD64表達(dá)水平高于肺部惡性腫瘤，低于健康體檢者和肺部良性疾病患者(t=11.024、10.963、4.696、11.400，P均<0.05)。見表1。

表1 各組外周血中性粒細(xì)胞水平的比較

2.2外周血中性粒細(xì)胞相對表達(dá)量 觀察組的TLR2、TLR4及CRP相對表達(dá)量均高于健康體檢者和肺部良性疾病患者，但低于肺部惡性腫瘤患者(t=8.320、7.512、6.829，P均<0.05)。見表2。

表2 各組外周血中性粒細(xì)胞相對表達(dá)量的比較

2.3不同分期結(jié)核病患者外周血中性粒細(xì)胞水平及相對表達(dá)量 進(jìn)展期患者的CD3、CD4、CD8均低于穩(wěn)定期和好轉(zhuǎn)期患者，但CD64表達(dá)水平高于穩(wěn)定期和好轉(zhuǎn)期患者(t=8.206、12.412、6.281、10.027，P均<0.05)；進(jìn)展期患者的TLR2、TLR4、CRP相對表達(dá)量均高于穩(wěn)定期和好轉(zhuǎn)期(t=9.213、8.236、7.028，P均<0.05)。見表3。

表3 不同分期結(jié)核病患者外周血中性粒細(xì)胞水平及相對表達(dá)量的比較

3 討 論

結(jié)核病是一種傳染性非常強(qiáng)的慢性疾病，可通過咳嗽、談吐、說話等在空氣中傳播結(jié)核分枝桿菌，使他人受到感染[7]。近年來，隨著生態(tài)環(huán)境污染日益加劇及艾滋病疾病的傳播，結(jié)核病的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅到人們的健康乃至生命安全，其防治形勢不容樂觀[8]。抗菌藥物是當(dāng)前結(jié)核病治療的常見方式，盡管能夠取得一定的效果，但是由于耐藥性問題的日益嚴(yán)峻，在很大程度上影響了治療的效果，尤其是多重耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，嚴(yán)重制約了抗菌藥物治療價(jià)值的提升[9]。因此，有必要加強(qiáng)對結(jié)核病相關(guān)問題的研究，這顯得十分有必要。

Fcy受體對于中性粒細(xì)胞的吞噬作用發(fā)揮著十分重要的作用，它們在所有吞噬細(xì)胞上表達(dá)，因此針對其與結(jié)核病

感染期間水平的檢測十分重要[10]。本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血中性粒細(xì)胞CD3、CD4、CD8均低于對照組，高于實(shí)驗(yàn)組，而CD64水平高于對照組，低于實(shí)驗(yàn)組，說明了相較于結(jié)核病患者Fcy受體的表達(dá)有所上升，集中體現(xiàn)在CD64表達(dá)水平的上升。由此不難看出，F(xiàn)cy受體是參與抗原吞噬作用和相關(guān)功能調(diào)節(jié)。有研究指出[11]，TLRs受體在結(jié)核分枝桿菌的識別中扮演著十分重要的角色。國外有研究發(fā)現(xiàn)[12]，通過中性粒細(xì)胞TRLs可對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行識別，其中以TLR2為例，其表達(dá)水平在感染結(jié)核分枝桿菌后明顯變化。炎性因子在感染后，其表達(dá)會發(fā)生相應(yīng)的變化，其中CRP的變化尤為明顯。本研究中，觀察組TLR2、TLR4及CRP相對表達(dá)量均高于對照組，但低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，表明了對于結(jié)核病患者而言，在感染后機(jī)體炎性因子的確發(fā)生了相應(yīng)的變化。進(jìn)一步分析相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，相較于穩(wěn)定期和好轉(zhuǎn)期患者，進(jìn)展期結(jié)核病患者CD3、CD4、CD8更低，CD64、TLR2、TLR4及CRP相對表達(dá)量(P<0.05)，這充分提示了TLR2、TLR4及CRP參與了病情的發(fā)生、發(fā)展，對機(jī)體免疫功能會造成較大的影響。

綜上所述，結(jié)核病患者的中性粒細(xì)胞CD64、TLR2、TLR4表達(dá)水平(量)會有明顯上升，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受到影響，因此需加強(qiáng)相關(guān)檢測，以為臨床提供科學(xué)的理論參考。