喬煒超，田甜，夏青，張妞

承德市第三醫(yī)院，河北 承德 067000

胰腺癌是目前臨床上預(yù)后極差的腫瘤之一，具有發(fā)病隱匿、分化差和高轉(zhuǎn)移率等特征[1]。目前，臨床上治療該病以根治性手術(shù)切除為主，術(shù)后輔助化療，但患者術(shù)后5年生存率仍不足20%[2]。據(jù)報道，約30%患者在術(shù)后1年內(nèi)胰腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，30%患者在術(shù)后2年內(nèi)發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[3]，因此，研究胰腺腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制十分必要，同時也需要在化療基礎(chǔ)上探索新的治療方案提高患者5年生存率。臨床上胰腺癌常見化療方案為吉西他濱+替吉奧，這種治療方式在治療疾病的同時也給患者免疫功能、消化系統(tǒng)等帶來副作用，出現(xiàn)白細(xì)胞降低、嘔吐、脫發(fā)、藥物性發(fā)熱、口腔潰瘍等[4]。承德市第三醫(yī)院擬制的益氣活血解毒方可幫助患者減輕化療后不良反應(yīng)，提高患者免疫功能，但其是否能夠抑制胰腺腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移尚不清楚?；诖耍狙芯客ㄟ^培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株及種植胰腺腫瘤的裸鼠觀察益氣活血解毒方對胰腺腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞與動物人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1(美國菌種保藏中心，目錄號：HTB-52)。4周齡左右健康清潔級雌性裸鼠25只，體質(zhì)量(18±2.5)g，由江蘇省動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2018-0019，實驗動物飼養(yǎng)設(shè)施使用許可證號：SYXK(蘇)2017-0003。所有裸鼠于層流架內(nèi)分籠飼養(yǎng)，專人負(fù)責(zé)管理。實驗室定期消毒，環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%。飼養(yǎng)1周后開始實驗。本研究經(jīng)承德市第三醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號：20201056)，符合中國倫理委員會有關(guān)動物研究指導(dǎo)原則。

1.2 藥物與試劑Trizol試劑、Transwell小室、即用型PBS粉劑、熒光定量siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：15596018、140644、12500096、AM1631)；細(xì)胞裂解液(美國Sigma-Aldrich公司，貨號：R0278)；絲氨酸/蘇氨酸激酶 30(serine/threonine kinase 30，STK30)兔多克隆抗體(美國Abcam公司，貨號：ab17464)；成纖維激活蛋白β(fibroblast activating protein β，F(xiàn)AB-β)兔多克隆抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：AZ050)；DMEM高糖培養(yǎng)基(上海微科生物技術(shù)有限公司，貨號：P04-03510)；胎牛血清(美國BIOIND公司，貨號：04-002-1A)；MagCellect Mouse CD4+CD25+Regulatory T Cell試劑盒(美國R&D公司，貨號：MAGM208)。

1.3 儀器HT-300型電子天平(成都倍賽克儀表研究所)；BMC512-IPL型倒置顯微鏡(江西鳳凰光學(xué)股份有限公司)；RT-2100C型全自動酶標(biāo)儀(美國雷杜公司)；Touch Imager型化學(xué)發(fā)光蛋白印跡成像儀[易孛特生命科學(xué)(上海)有限公司]；DYCZ-40B型轉(zhuǎn)印電泳儀、DYCZ-24A型雙垂直電泳儀(北京六一儀器廠)；D2012plus型臺式離心機(jī)[離心半徑：10 cm，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司]；7500型實時定量PCR儀(美國ABI公司)；MAGLUMI 4000 Plu型化學(xué)發(fā)光分析儀(深圳Snibe醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)；HD-650型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備儀器公司)；CytoFLEX型流式細(xì)胞儀[貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司]。

2 方法

2.1 藥物制備取益氣活血解毒方組方藥材黃芪12 g，白術(shù)12 g，山藥12 g，三棱9 g，青皮9 g，山慈菇9 g，桔梗6 g及全蝎6 g。加水浸泡后煎煮制備取濾液，煎煮2次，合并濾液，測定原液每毫升含生藥2.2 g；采用0.9%生理鹽水配置成濃度為3 mg·L-1、6 mg·L-1和9 mg·L-1的藥液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時，使用siRNA對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用PBS對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行清洗后，接種到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。取對數(shù)生長期的siRNA轉(zhuǎn)染后的PANC-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL-1，接種于96孔板上，每孔0.1 mL，分為觀察組、化療組及益氣活血解毒方低、中、高濃度組。觀察組加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；化療組加入含6 mg·L-1吉西他濱與替吉奧混懸液和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；益氣活血解毒方低、中、高濃度組分別加入含6 mg·L-1吉西他濱與替吉奧混懸液及3 mg·L-1、6 mg·L-1和9 mg·L-1益氣活血解毒方溶液和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每孔0.1 mL，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行遷移、侵襲實驗。

2.3 動物分組、模型建立與給藥25只4周齡左右健康清潔級雌性裸鼠隨機(jī)分為觀察組、化療組及益氣活血解毒方低、中、高濃度組，每組裸鼠于腹部皮下注射1 mL細(xì)胞密度為5×105mL-1的PANC-1細(xì)胞懸液，觀察其腹部腫瘤生長狀況。4周后，當(dāng)裸鼠腹部出現(xiàn)1.0～2.0 cm腫瘤時，于其腹股溝靜脈留置導(dǎo)管，除觀察組外，其余組經(jīng)導(dǎo)管注射1 g·L-1的吉西他濱與替吉奧混懸液，每日1次；益氣活血解毒方低、中、高濃度組在此基礎(chǔ)上，分別灌胃給予 10 g·L-1、20 g·L-1及30 g·L-1的益氣活血解毒方溶液，每日1次，連續(xù)給藥4周。

2.4 細(xì)胞遷移實驗細(xì)胞處理同2.2，將處理過的PANC-1細(xì)胞均勻接種于Transwell小室，加入DEDM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×105mL-1，共12孔，分別于培養(yǎng)2 h、4 h、6 h時隨機(jī)取4孔，吸取上室培養(yǎng)基，擦除表面細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗，將小室倒置晾干后使用0.1%的結(jié)晶紫染液染色 10 min。PBS清洗后將小室置于倒置顯微鏡下觀察從小室外側(cè)穿入內(nèi)側(cè)細(xì)胞數(shù)。

2.5 細(xì)胞侵襲實驗細(xì)胞處理同2.2，將處理過的PANC-1細(xì)胞均勻接種于Transwell小室，上室中加入稀釋后的BD基質(zhì)膠，于室溫下培養(yǎng)2 h。再加入DEDM混懸液調(diào)整細(xì)胞密度為6.0×105mL-1，分別于培養(yǎng)2 h、4 h、6 h時隨機(jī)取4孔上室，吸取其培養(yǎng)基，擦除其表面細(xì)胞液，PBS清洗，將小室倒置晾干，使用0.1%的結(jié)晶紫染液染色10 min。PBS清洗后，將小室置于倒置顯微鏡下觀察從小室外側(cè)穿入內(nèi)側(cè)細(xì)胞數(shù)。

2.6 Western Blot檢測SKT30、FAB-β蛋白表達(dá)水平選取各組對數(shù)生長期的細(xì)胞(細(xì)胞密度為2.0×105mL-1)，吸取約2 mL，用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，8 000 r·min-1離心6 min，加入新的EP管中。使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白測算蛋白樣品濃度后，進(jìn)行蛋白上樣、電泳和轉(zhuǎn)PVDF膜。洗膜后分別加入SKT30與 FAB-β 抗體(稀釋比例為11 000)，4 ℃下孵育過夜。再加入二抗(稀釋比例為1200)進(jìn)行孵育，洗膜后，使用化學(xué)發(fā)光儀對其進(jìn)行檢測，并用Piclab軟件分析蛋白表達(dá)量。

2.7 流式細(xì)胞儀檢測裸鼠CD4+CD25+T細(xì)胞的比例使用CytoFLEX型流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+T細(xì)胞占比。裸鼠治療前和化療4周后，取其腹股溝靜脈血，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液；按MagCellect Mouse CD4+CD25+Regulatory T Cell試劑盒說明書操作檢測血清中CD4+CD25+T的比例。

3 結(jié)果

3.1 益氣活血解毒方對胰腺癌晚期腫瘤細(xì)胞遷移的影響細(xì)胞處理2 h時，各組細(xì)胞遷移能力無明顯差異。細(xì)胞處理4 h時，與觀察組比較，各治療組遷移細(xì)胞數(shù)量均有所降低，其中益氣活血解毒方中、高濃度組遷移細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)。細(xì)胞處理6 h時，與觀察組比較，各治療組遷移細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)；與化療組比較，益氣活血解毒方高濃度組遷移細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 益氣活血解毒方對胰腺癌晚期腫瘤細(xì)胞遷移的影響 個)

3.2 益氣活血解毒方對胰腺癌晚期腫瘤細(xì)胞侵襲作用的影響細(xì)胞處理2 h時，各組細(xì)胞侵襲能力無明顯差異。細(xì)胞處理4 h時，與觀察組比較，各治療組侵襲細(xì)胞數(shù)量均有所降低，其中益氣活血解毒方中、高濃度組侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)。細(xì)胞處理6 h時，與觀察組比較，各治療組侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)；與化療組比較，益氣活血解毒方高濃度組侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 益氣活血解毒方對胰腺癌晚期腫瘤細(xì)胞侵襲作用的影響 個)

3.3 益氣活血解毒方對胰腺癌晚期腫瘤細(xì)胞STK30、FAB-β蛋白表達(dá)水平的影響與觀察組比較，各治療組STK30、FAB-β蛋白表達(dá)水平均有所降低，其中益氣活血解毒方中、高濃度組STK30、FAB-β蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 益氣活血解毒方對胰腺癌晚期腫瘤細(xì)胞STK30、FAB-β蛋白表達(dá)水平的影響

圖1 STK30、FAB-β蛋白Western Blot電泳圖

3.4 益氣活血解毒方對胰腺癌大鼠免疫功能的影響治療前及治療2周后，各組大鼠血清CD4+CD25+T細(xì)胞占比無明顯差異。治療4周后，與治療前比較，化療組CD4+CD25+T細(xì)胞占比明顯降低(P<0.05)；與觀察組比較，益氣活血解毒方中、高濃度組CD4+CD25+T細(xì)胞占比明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清CD4+CD25+T細(xì)胞占比比較

4 討論

胰腺癌是一種分化極差的消化道腫瘤，由于胰腺解剖位置位于后腹膜，患者早期癥狀不明顯且易被誤診。研究顯示，胰腺癌的發(fā)病率和病死率逐年升高，目前，我國胰腺癌的發(fā)病率位列惡性腫瘤的第八位，胰腺癌早期診斷率僅占5%，手術(shù)切除率低，5年生存率15%～20%，局部進(jìn)展期胰腺癌占30%～40%[5]，這類患者確診后往往不具備手術(shù)指征，而化療藥物使用在提高患者5年生存率上效果不明顯，這與胰腺腫瘤細(xì)胞具有低分化、高侵襲性相關(guān)。

據(jù)研究報道[6]，通過對已切除的胰腺導(dǎo)管癌進(jìn)行病理分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞增殖與細(xì)胞內(nèi)K-ras基因突變率異常增高及體內(nèi)抑癌基因p23表達(dá)抑制相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，炎性因子、氧化因子等在胰腺腫瘤患者切除胰腺中高表達(dá)，具體表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞中胰腺星狀細(xì)胞過度分泌血小板來源生長因子。血小板來源生長因子與腫瘤細(xì)胞表面糖蛋白結(jié)合，使得腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞膜表面生長出偽足，并沿著該生長因子分泌路徑蔓延，促進(jìn)胰腺腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲[7-8]。FAB-β是血小板來源生長因子在胰腺星狀細(xì)胞中表達(dá)的關(guān)鍵激酶，因此，本次研究將其作為觀察指標(biāo)之一。同時據(jù)研究報道，在p23基因抑制的腫瘤細(xì)胞中，降低SKT30表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]，且在卵巢癌及肺癌患者中，STK30表達(dá)上升都提示腫瘤細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。

常規(guī)化療時，患者腫瘤細(xì)胞在被殺傷的過程中，正常免疫細(xì)胞同樣被抑制，正常組織中免疫細(xì)胞減少，不利于清除轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞，為日后腫瘤復(fù)發(fā)埋下禍根。據(jù)研究報道[10]，CD4+CD25+T細(xì)胞是非特異性應(yīng)答的核心細(xì)胞，機(jī)體內(nèi)數(shù)量減少會導(dǎo)致自身免疫病、腫瘤、感染等發(fā)生。當(dāng)CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)異常時，組織內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)下降，M2型巨噬細(xì)胞可以吞噬過量表達(dá)的炎癥因子改善腫瘤微環(huán)境，并且可提交表面抗原-抗體復(fù)合物給自然殺傷細(xì)胞，趨化其到腫瘤細(xì)胞周圍，發(fā)揮殺傷作用[11]。

益氣活血解毒方具有通絡(luò)活血、益氣解毒的作用，方中白術(shù)和黃芪可以起到補(bǔ)氣、散去郁結(jié)的作用，對脾臟大有裨益；同時三棱、桔?？上鲅ǚ螝?，有利于消除正常胰腺組織中炎癥和氧化因子，改善胰腺腫瘤微環(huán)境[12-13]。同時，益氣活血解毒方中的黃芪含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷，可抑制腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核血管生長因子的基因表達(dá)，減少該因子分泌，抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生遷移[14]。方中山慈菇含有杜鵑蘭素Ⅰ和Ⅱ，具有抑制血管生長因子的能力，可上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)腫瘤抑制基因B-細(xì)胞淋巴瘤因子3(B-cell lymphoma 3，Bcl-3)，激活Bcl-CXC通路，CXC趨化因子是間質(zhì)細(xì)胞中趨化因子集合，其中CXCR-7是細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)跨膜受體。當(dāng)Bcl基因抑制時，CXCR-7表達(dá)增加，有利于腫瘤細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞趨化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲作用[15-16]。

從本次研究結(jié)果可以看出，在細(xì)胞處理2 h時，各組細(xì)胞遷移能力無明顯差異，而在細(xì)胞處理4 h和6 h時，胰腺癌晚期腫瘤細(xì)胞在化療藥物及益氣活血解毒方作用下，其遷移細(xì)胞數(shù)量隨著時間推移逐漸下降；細(xì)胞處理4 h時，益氣活血解毒方中、高濃度組遷移細(xì)胞數(shù)量明顯低于觀察組；細(xì)胞處理6 h時，化療組及益氣活血解毒方低、中、高濃度組遷移細(xì)胞數(shù)量明顯低于觀察組，同時益氣活血解毒方高濃度組遷移細(xì)胞數(shù)量明顯低于化療組，說明益氣活血解毒方可以減弱胰腺腫瘤細(xì)胞遷移。細(xì)胞遷移又稱為細(xì)胞爬行，指細(xì)胞通過感受化學(xué)信號傳導(dǎo)，改變自身形態(tài)，如伸出偽足，發(fā)生空間上位移[17]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞遷移加速時，腫瘤細(xì)胞增殖加快?；熕幬锛魉麨I和替吉奧通過殺傷腫瘤細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)線粒體上磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3Ks)能量通路，減慢高爾基體上氨基酸合成與折疊，從而使得細(xì)胞膜上膜蛋白數(shù)量減少，無法改變細(xì)胞形態(tài)[18]。血管生長因子分泌后，可升高細(xì)胞周圍氧化因子濃度，改變周圍氧濃度梯度，介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生遷移。在細(xì)胞處理2 h時，各組細(xì)胞侵襲能力無明顯差異，而在細(xì)胞處理4 h和細(xì)胞處理6 h時胰腺癌晚期腫瘤細(xì)胞在化療藥物及益氣活血解毒方作用下，其侵襲細(xì)胞數(shù)量隨著時間推移逐漸下降；細(xì)胞處理4 h時，益氣活血解毒方中、高濃度組侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯低于觀察組；細(xì)胞處理6 h時，各治療組侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯低于觀察組，同時益氣活血解毒方高濃度組侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯低于化療組。細(xì)胞侵襲是指腫瘤細(xì)胞通過浸潤到達(dá)組織間質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步破壞周圍組織和器官的過程，它是腫瘤細(xì)胞發(fā)生器官轉(zhuǎn)移的必要前提。替吉奧作為一種氟尿嘧啶類似物，進(jìn)入細(xì)胞后可活化成為5-氟尿嘧啶，抑制細(xì)胞核上磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，降低DNA復(fù)制速率，減緩腫瘤細(xì)胞過度增殖[19]。分析與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，STK30在觀察組胰腺癌晚期遷移細(xì)胞中表達(dá)較高，隨著益氣活血解毒方濃度升高而表達(dá)降低，其中益氣活血解毒方中、高濃度組STK30表達(dá)明顯低于觀察組；FAB-β在觀察組胰腺癌晚期侵襲細(xì)胞中表達(dá)較高，隨著益氣活血解毒方濃度升高而表達(dá)降低，其中益氣活血解毒方中、高濃度組FAB-β表達(dá)明顯低于觀察組。STK30存在于人體多種細(xì)胞中，與細(xì)胞增殖相關(guān)，據(jù)研究報道，胰腺腫瘤組織中STK30表達(dá)明顯高于周圍正常細(xì)胞[20]。STK30的表達(dá)主要與胰腺細(xì)胞發(fā)生遷移有關(guān)，推測其可能與胰腺腫瘤細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)相關(guān)。K-ras基因突變是胰腺細(xì)胞發(fā)生癌變的主要原因，而化療藥物吉西他濱可靶向作用于胰腺細(xì)胞細(xì)胞核上K-ras突變基因序列，但是當(dāng)細(xì)胞中STK30表達(dá)上調(diào)后，可抑制吉西他濱作用于細(xì)胞核上的K-ras突變基因上游通路，阻斷對胰腺腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[21]。通過本次研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血解毒方可以通過降低STK30的蛋白表達(dá)，達(dá)到抑制胰腺癌遷移細(xì)胞在體內(nèi)增殖的作用，推測其作用與該方中青皮有關(guān)，它富含左旋辛弗林乙酸鹽和天冬氨酸、胱氨酸等，其中左旋辛弗林乙酸鹽可以介導(dǎo)青皮中天冬氨酸與胱氨酸進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)通路，生成CK-21偶聯(lián)蛋白激酶，作用于細(xì)胞核STK30基因序列，抑制其表達(dá)[22]。而FAB-β主要與胰腺癌細(xì)胞侵襲有關(guān)，據(jù)報道，F(xiàn)AB-β 主要存在于胰腺星狀細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，一般處于不表達(dá)狀態(tài)，只有當(dāng)胰腺細(xì)胞發(fā)生炎癥、損傷時，F(xiàn)AB-β被激活，產(chǎn)生FAB蛋白合成酶，生成SKD生物信號肽，分泌到胰腺間質(zhì)組織中，通過旁分泌方式與胰腺腫瘤侵襲細(xì)胞接觸，介導(dǎo)其向分泌高濃度信號肽的間質(zhì)細(xì)胞侵襲[23]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，治療4周后，化療組CD4+CD25+T細(xì)胞占比明顯低于治療前；同時益氣活血解毒方中、高濃度組大鼠血清CD4+CD25+T細(xì)胞占比明顯高于化療組，說明益氣活血解毒方可以提高因化療導(dǎo)致的免疫功能下降，考慮與該方中黃芪和三棱有關(guān)，黃芪中黃酮素可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞與胰腺間質(zhì)細(xì)胞附著，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成。而三棱中的棕櫚酸可作用于胸腺細(xì)胞細(xì)胞膜上跨膜蛋白，阻斷化療藥物進(jìn)入胸腺細(xì)胞內(nèi)，使其正常分泌淋巴調(diào)節(jié)因子[24]。

綜上所述，益氣活血解毒方可以降低胰腺癌晚期胰腺細(xì)胞的遷移和侵襲，其作用與降低胰腺癌細(xì)胞中SKT30、FAB-β的蛋白表達(dá)水平有關(guān)；同時該方可以提高化療后胰腺癌大鼠免疫功能，可考慮進(jìn)入下一步臨床研究。